论文部分内容阅读
【LRRC4基因的克隆、生物信息学特征及前期研究结果】LRRC4基因是本室王洁如博士在鼻咽癌全基因组扫描和比较基因组杂交分析的基础上，采用定位候选结合5'-RACE技术从染色体7q31-32区域克隆的一个新基因，当时命名为NAG14(Genbank接受号为AF196976)。生物信息学预测NAG14含有多个富亮氨酸重复结构(1eucine-richrepeat，LRR)，因而被人类基因组命名委员会重命名为LRRC4。多组织膜Northern-blot分析显示LRRC4在人、鼠组织均表现出脑相对特异表达的特点，而在脑瘤组织(80％)，尤其是脑胶质瘤组织(87.5％，21/24)中表达缺失或下调。前期有关LRRC4基因功能的研究发现：LRRC4基因的重表达能够通过抑制磷酸化的ERK1/2，下调PCNA，上调P21和P27，抑制CDK2激酶活性将脑胶质母细胞瘤U251细胞阻滞在G0/G1期，抑制U251细胞的体外生长，同时，裸鼠皮下移植瘤形成实验表明LRRC4能够明显的抑制U251细胞的体内生长。综上所述，LRRC4基因可能是一个与脑瘤特别是恶性胶质瘤的发生密切相关的候选抑瘤基因。
【LRRC4基因在恶性胶质瘤细胞系中的表达分析】研究表明，一个候选的肿瘤抑制基因的确定除了检测该基因在体内、外抑制肿瘤细胞的生长作用外，还要进行细胞和分子遗传学分析检测该基因在肿瘤细胞中的表达及突变频率。Northern-blot和RT-PCR结果显示，LRRC4基因在U251、U87、SF126、SF767、BT325和M17等六种恶性胶质瘤细胞系中表达均缺失。为了明确LRRC4基因在恶性胶质瘤细胞系中表达缺失是否由编码区序列的突变引起，进一步从这几种细胞系的基因组DNA中扩增LRRC4基因的编码区序列并进行测序分析。结果发现，SF126、SF767和M17三种细胞基因组DNA中均可扩增出LRRC4基因的编码区序列，但产量明显低于管家基因GAPDH，测序分析表明三种胶质瘤细胞中扩增出来的LRRC4基因均在第279位氨基酸的第三位密码子发生了同义突变(LRRC4基因的第977位，T→A)。因此，LRRC4基因在这三种胶质瘤细胞系中表达缺失不是基因突变所致。而U251和U87细胞基因组DNA中未能扩增出LRRC4基因的编码区序列。搜索NCBI的FISH和CGH数据库显示，U251细胞在7pter-14和7q32-ter区域存在纯合性缺失。因此，LRRC4基因在U251细胞中表达缺失是由于染色体7q32-ter的纯合性缺失所致，这同时也将LRRC4在7号染色体上的定位缩小到7q32末端，而不再是7q31-32。
【LRRC4通过LRR结构域抑制U251细胞的体外生长】SMART软件预测发现LRRC4含有保守的LRR和IgC2结构域。LRR结构域(LRRcassette)是由核心LRRs(thecoreLRRs)和两端富含保守的半胱氨酸位点的末端LRR(LRRNT和LRRCT)组成。
研究表明，只有作为受体、受体激酶或黏附分子的LRP(1eucine-richrepeatprotein)的核心LRRs两端才同时含有N和C末端LRR。LRRC4的这种结构特点表明LRRC4可能是一个受体、受体激酶或黏附分子，参与细胞生长和侵袭的调控。本实验采用一步PCR法构建一系列缺失突变体，转染至U251细胞，通过MTT和软琼脂集落形成实验探讨LRR和IgC2结构域对LRRC4抑制U251细胞生长的影响。结果发现：LRRC4抑制U251细胞的生长依赖于它的LRR结构域，而不是IgC2或Tm结构域。第三个核心LRR基序是LRRC4抑制U251细胞体外生长所必需的。当第三个LRR缺失后，LRRC4不再抑制U251细胞的生长。IgC2或Tm结构域的缺失对LRRC4抑制U251细胞生长几乎没有影响。同时，pEGFP-LRRC4野生型及突变体质粒转染Cos7细胞发现，N和C末端的LRR决定了LRRC4蛋白的膜浆定位。
【LRRC4通过LRR结构域调控ERK/AKT/NF-κB信号转导通路】研究表明很多与神经系统生长发育相关的富亮氨酸重复蛋白(Leucine-richrepeatprotein，LRP)通过LRR结构域与ras-likeGTPases发生相互作用而调控Ras相关的信号转导通路，调控神经细胞的增殖与分化。ERK/MAPK是Ras依赖的信号转导通路，在胶质瘤细胞中该通路过度激活。活化的ERK-MAPK招募PI-3K的p85亚单位，催化PI-3K的p11O亚单位与PI-3K/AKT通路发生cross-talk。活化的AKT可通过活化Iκκ或直接磷酸化NF-κBp65亚单位而激活NF-κB调控细胞周期、细胞分化或凋亡基因的转录。Western-blot检测结果发现LRRC4可以抑制pERK和pAKT，pNF-κBp65的表达。
用ERK/MAPK信号通路的抑制剂PD98059和PI-3K/AKT通路的抑制剂LY294002处理转染和未转染LRRC4的U251细胞发现，LRRC4以ERK依赖的方式抑制pAKT/pNF-κBp65的表达。缺失突变分析显示LRRC4抑制ERK和AKT的磷酸化表达依赖于它的LRR结构域，而不是IgC2结构域。LRRC4通过抑制pERK/pAKT/pNF-κBp65亚单位的磷酸化表达，下调细胞周期调控蛋白CyclinD1和CDK2，延缓U251细胞通过G1期进入S期，将U251细胞大部分阻滞在G0/G1期。另外，LRRC4还可通过LRR、IgC2和Tm区共同调控JNK2/c-Jun/p53通路，导致U251细胞中突变型的p53表达下调，p21、p27上调，CDK2下调，细胞阻滞在G0/G1期。但LRRC4不诱导U251细胞的凋亡。
【LRRC4通过LRR结构域抑制U251细胞的侵袭】ScanProsite-Protein软件搜索LRRC4蛋白翻译后的修饰预测表明LRRC4含9个糖基化位点，糖基化位点是许多细胞黏附分子的特征；同时LRRC4的LRR结构域的特点也表明LRRC4是一个跨膜糖蛋白，可能是一种黏附受体(黏附分子)参与细胞与细胞，细胞与细胞外基质之间的黏附，调控胶质瘤细胞的侵袭行为。U251细胞是Ⅳ级胶质母细胞瘤细胞，具有高度的侵袭性。利用Transwell体外侵袭模型研究发现，LRRC4通过LRR结构域减弱U251细胞的侵袭能力。此外，LRRC4还可以通过LRR结构域使U251细胞的细胞间隙连接通讯能力提高。1-6LRR缺失后，LRRC4突变体蛋白仍然具有抑制侵袭和增强细胞间隙通讯连接的能力。但当核心LRRs缺失后，LRRC4蛋白抑制U251细胞的侵袭能力和提高细胞间隙通讯连接的能力丧失。这些结果表明，LRRC4抑制U251细胞的侵袭依赖于它的LRR结构域，而不是IgC2结构域。其中，第七个核心LRR基序是LRRC4抑制胶质母细胞瘤细胞侵袭所必需。
前期利用BD公司的细胞因子和受体cDNAarray杂交研究了LRRC4的重表达对U251细胞基因表达谱的影响发现，LRRC4可以调控很多细胞因子和受体的表达。其中，肝素结合蛋白PTN的受体RPTP-zeta引起了我们的注意。RPTP-zeta参与了肿瘤细胞的侵袭和转移。研究显示，表达RPTP-zeta的U251和U87细胞具有侵袭能力，而不表达RPTP-zeta的SF767和M17细胞则不具有侵袭能力。LRRC4可以抑制RPTP-zeta的表达。因此，本文认为LRRC4抑制胶质瘤细胞的侵袭能力可能是通过抑制RPTP-zeta的表达，进而调控上述信号转导通路而实现的。
综上所述，LRRC4蛋白通过核心LRRs两端富含半胱氨酸的N和C末端LRR，定位于膜和浆。LRRC4通过LRR结构域调控ERK/AKT/NF-κB和JNK2/c-Jun/p53信号通路共同将U251细胞阻滞在G0/G1期，抑制细胞的增殖和侵袭。总之，LRRC4作为一个本室自主克隆的新的脑瘤候选抑瘤基因，具有很高的科研价值。目前有关LRRC4的功能研究刚刚起步，深入对该基因抑瘤功能及作用机制的研究，将为脑瘤的发生发展机理提供极具优势的理论及实验依据。