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肺腺癌作为肺癌最重要的病理类型之一,其死亡率和发病率逐年升高。虽然随着早期肺腺癌低剂量螺旋计算机体层扫描术(low dose computed tomography,LDCT)筛查的广泛开展和手术技术的改进,肺腺癌死亡率有所下降,但是由于肺腺癌具有早期转移和复发的特点,导致5年生存率仅为30%左右。然而肿瘤细胞恶性增殖往往是导致患者预后不佳的重要原因之一。肿瘤恶性增殖是一个多阶段、多因素和多步骤的复杂过程,所以如何正确解析肺腺癌恶性增殖机制,寻找潜在的分子治疗靶点,是当前需要研究的重要课题之一。肺腺癌具有的恶性生物学行为主要是由于肿瘤细胞失控性增殖引起的。在正常生物个体中细胞的增殖活动受到细胞周期检查点的严格限制,以确保DNA的准确复制和染色体的再分配,是涉及多个基因和蛋白协同配合的精确调控过程。细胞分裂周期蛋白25磷酸酶A(cell division cyclin 25A,CDC25a)是特异性磷酸酶家族成员之一,它在细胞周期G1/S转变过程中扮演重要角色。许多学者发现很多核转录因子(STAT3、FOXM1、E2F和CBP等)能够直接或间接启动CDC25a启动子转录活性,同时也存在一些转录因子(p21、Smad3/4)能够抑制或下调CDC25a启动子转录活性。那么推测是否还有其他核转录因子能够在肺腺癌发生发展过程中启动CDC25a的转录,扰乱细胞周期检测机制从而加速肿瘤恶性增殖的活性哪?人类Y-Box蛋白(Y box-binding protein-1,YBX1)作为近年来肿瘤基础研究领域的最新成就,有望解决这一瓶颈问题。YBX1基因是DNA-binding蛋白基因家族的成员之一,是重要的核转录因子。它通过捆绑Y-box序列5’-CTGATTGG-3’来调控基因表达,而Y-boxes存在于许多基因的启动子上。从目前的基础研究结果来看,人类YBX1蛋白的功能主要体现在三个方面:①细胞周期重要的调控因子;②肿瘤细胞化疗耐药监测因子;③DNA损伤后修复因子。因此,YBX1蛋白介导的肿瘤增殖信号调控网络可能是多种肿瘤治疗方法所共同作用的具有普遍意义的终极标靶。大量研究表明在乳腺癌、胃癌、结肠癌等癌肿中,YBX1直接或间接加快肿瘤细胞周期进程并能够抑制细胞周期抑制性蛋白的活性,如p53、p21和p27等,但具体的作用机制仍不明确。前期通过生物信息学的方法对CDC25a启动子区域(GenBank:AJ242714.1)进行核苷酸比对,发现其含有三个可能被YBX1蛋白结合的反向CCAAT序列。因此推测是否在肺腺癌的发生发展过程中,YBX1能够特异性结合在CDC25a启动子上,并能正向调控其转录,进而激活CDC25a信号通路导致肿瘤细胞的恶性增殖过程。本研究拟利用siRNA干扰系统、SDS-PAGE、流式细胞术、免疫细胞化学染色以及动物模型实验,阐明YBX1和CDC25a基因之间的关系,解析YBX1蛋白通过CDC25a信号通路介导肺腺癌增殖的分子机制;同时建立YBX1/CDC25a基因对肺腺癌高危患者术后早期预测评价体系,以期为肺腺癌患者的“精准治疗”提供可靠的参考。第一部分:YBX1和CDC25a在肺腺癌组织和细胞中的表达及预后研究目的:探讨YBX1蛋白和CDC25a蛋白在不同肺腺癌亚型中的表达情况,回顾性分析不同临床病理因子在肺腺癌患者中的预后价值;同时明确不同肺腺癌细胞系和正常肺上皮细胞系中YBX1与CDC25a蛋白的定位和表达情况。方法:收集2008年1月到2010年12月大连医科大学附属第一医院经手术后病理证实肺腺癌患者共计116例(中位年龄64岁,年龄区间45-86岁),采用免疫组织化学染色的方法测定组织标本中YBX1与CDC25a蛋白的表达情况并对病例进行预后分析,同时利用Western blot技术和免疫荧光染色技术探讨不同肺腺癌细胞系中YBX1与CDC25a蛋白的定位和表达情况。结果:肺腺癌组织中YBX1蛋白的表达差异与肿瘤大小T(p=0.006)、TNM分期(p=0.006)和CDC25a蛋白表达(p=0.016)相关,而与性别、年龄、组织分化和IASLC/ATS/ERS肺腺癌新分类无关(p>0.05)。而CDC25a蛋白表达却与组织分化(p=0.007)、淋巴转移(p=0.026)、TNM 分期(p=0.033)、IASLC/ATS/ERS 肺腺癌新分类(P<0.001)密切相关。单因素分析发现IASLC/ATS/ERS肺腺癌分级(p=0.037)、组织分化(p=0.001)、淋巴转移(p=0.008)、CEA 浓度(p=0.045)、CDC25a 表达(p=0.004)、YBX1表达(p=0.044)以及TNM分期(p<0.001)与肺腺癌患者总体生存密切相关。而在Cox模型多因素分析中发现高TNM分期(HR=3.428,95%CI:1.519-7.737,p=0.003)与 CDC25a蛋白过表达(HR=2.384,95%CI:1.008-7.642,p=0.048)是影响患者生存的独立危险因子。肺腺癌细胞株中YBX1和CDC25a蛋白表达明显强于正常肺上皮细胞,并出现明显的核移位现象。结论:在肺腺癌中YBX1与CDC25a蛋白表达成正相关;CDC25a蛋白表达差异和TNM分期是影响肺腺癌患者预后的独立危险因子;YBX1和CDC25a蛋白在肺腺癌细胞株中存在过表达现象。第二部分:YBX1通过CDC25a信号通路干预肺腺癌增殖的机制研究目的:探讨YBX1对CDC25a启动子活性的影响,解析YBX1对细胞周期CDC25a信号通路的调控机制,同时验证YBX1蛋白对肺腺癌肿瘤恶性生物学行为的影响。方法:首先利用染色质免疫共沉淀技术和荧光报告基因检测技术验证YBX1与CDC25a启动子区域的特异性行结合;其次利用RT-PCR技术和Western blot技术在分子水平证明YBX1蛋白对CDC25a信号通路的影响;最后通过克隆形成实验、流式细胞术、塞唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide,MTT)实验以及划痕实验验证YBX1蛋白对肺腺癌肿瘤恶性生物学行为的影响。结果:YBX1蛋白与CDC25a启动子结合区域位于(-183-72)之间,而且能够正向调控CDC25a蛋白的转录活性。在肺腺癌细胞株中抑制YBX1蛋白表达能够使CDC25a、p-RB、cyclin D1和Stat3蛋白表达出现明显下调(p<0.05)和p21、p53蛋白表达上调(p<0.05),而其他蛋白CDK2、CDK4、CDK6和cyclinE1却未见明显变化。在细胞功能学方面,抑制YBX1蛋白表达后可以引起细胞周期G1/S期阻滞、细胞活性的减低(p<0.05)、克隆形成能力降低(p<0.05)、凋亡细胞增多(p<0.05)及细胞迁移能力降低(p<0.05)。结论:YBX1蛋白可以特异性结合在CDC25a启动子上,并能正向调控其转录;YBX1可以通过CDC25a信号通路调控肺腺癌细胞的细胞周期、增殖、凋亡及迁移能力。第三部分:肺腺癌裸鼠荷瘤模型中YBX1调控肿瘤增殖的相关研究目的:验证siRNAYBX1对裸鼠皮下肺腺癌荷瘤模型瘤组织的影响。方法:构建肺腺癌裸鼠荷瘤模型;利用siRNAYBX1注射治疗肺腺癌瘤组织,观察其生长;利用HE染色明确病灶病理结构变化;同时利用免疫组化染色明确病灶 YBX1、CDC25a、Ki67 及 cleave-caspase3 蛋白表达情况。结果:实验组(siRNAYBX1)裸鼠肿瘤平均体积(p<0.01)和瘤重(p<0.01)明显降低,免疫组织化学染色分析siRNAYBX1处理后肺腺癌荷瘤组织中YBX1、CDC25a和Ki67蛋白表达减少,但cleave-caspase3蛋白表达增多。结论:siRNAYBX1能够抑制裸鼠肺腺癌种植瘤的增殖活性,同时可降低病灶YBX1 CDC25a及Ki67蛋白表达和增加cleave-caspase3蛋白表达。