目的构建汉坦病毒(Hantavirus,HV)GM04-38株包膜糖蛋基因G1、G2的真核表达载体,并将其在Vero E6细胞中进行表达,研究其表达特点,并且观察细胞融合现象的发生,为研究汉坦病毒基因结构与功能、病毒糖蛋白的结构与功能、研制有效的汉坦病毒基因工程亚单位疫苗奠定基础。构建汉坦病毒糖基化位点的突变体,对以后研究糖基化位点改变对细胞融合的影响具有重要意义。方法根据GenBank SEO型HV M、S片段cDNA基因保守序列及相关参考文献设计引物,以质粒pUCm-M1和pMD18-M2为模板,应用PCR方法分别扩增HV糖蛋白G1、G2的全长基因,并在基因两端创建相应的酶切位点,将PCR产物和表达载体pCAGGS/MCS分别双酶切后连接,转化大肠杆菌DH5α,经氨苄筛选,酶切和测序鉴定正确后,两种载体分别命名为pCAGGS-G1、pCAGGS-G2,然后将两种糖蛋白载体共转染Vero E6细胞,酸性MEM处理、Giemsa染色后观察细胞融合现象的产生。同时用pCAGGS-NP与两种糖蛋白载体共表达,看核蛋白是否对糖蛋白的融合有增强作用,并以间接免疫荧光实验(indirect immunofluorescence assay,IIFA)来观察糖蛋白和核蛋白的表达情况。利用基因定点突变的方法构建了五个糖蛋白突变体,即将G1、G2上的的天冬酰胺置换为丙氨酸,根据被替换的位置,突变体分别命名为N134A、N235A、N347A、N399A、N928A。结果1.构建了含有包膜糖蛋白基因G1、G2的真核表达载体pCAGGS-G1和pCAGGS-G2,双酶切鉴定目的片段分别为2.0kb和1.5kb,载体片段为4.7kb并测序证实。2.间接免疫荧光试验显示糖蛋白组、核蛋白组及两者的共表达组皆有亮绿色荧光信号产生,呈胞浆分布。3.糖蛋白G1、G2共转染后在偏酸性条件下可引起Vero E6细胞发生融合,而转染pCAGGS-NP的细胞则没有融合现象发生;将核蛋白与糖蛋白共表达后也未出现明显的促进效应。4.构建了五个N-连糖基化位点的突变体,测序图谱显示原序列中的天冬酰胺(N)均被置换为丙氨酸(A)。结论成功构建了汉坦病毒包膜糖蛋白基因G1、G2的真核表达载体并在Vero E6细胞中有效表达,二者的共表达可以产生良好的生物学活性,在酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合。为进一步研究糖蛋白的结构与功能,制备有效的亚单位疫苗奠定了坚实基础。成功构建了各糖基化位点的突变体,为进一步研究N-连糖基化的缺失对细胞融合的影响提供了必要条件。