以木质纤维素生物转化产乙醇为代表的生物燃料的发展,不仅对我国应对能源危机有重要作用,同时其研究和实际应用也对环境保护和社会发展具有多方面长期有益影响,因此,对其开发利用已成为国内外研究的热点问题。在木质纤维素生物转化过程中,利用纤维素酶将木质纤维素降解为葡萄糖是关键步骤。但目前较高的用酶成本极大地限制了生物转化工业的大规模化生产。因此,通过构建高效产酶且酶系优良的纤维素酶生产菌株,以降低纤维素酶生产成本并有效减少转化过程中的纤维素酶用量,对于降低纤维素乙醇生产成本,促进其工业化生产具有重要意义,也是目前国内外研究的重要课题。草酸青霉114-2是本实验室筛选得到,有知识产权的纤维素酶生产菌株,与其它产纤维素酶菌株相比,其酶系丰富,特别是具有更完整的半纤维素酶系。更加适用于对成分复杂的木质纤维素原料的水解。经过长期研究,目前课题组在草酸青霉的基因组学和蛋白质组学、主要胞外分泌调控因子、胞外酶系构成以及酶作用机制等方面都有了较为深入的研究和了解。通过对菌株的一系列基因工程改造,先后获得了纤维素酶生产能力和水解底物能力提高的多株优良菌株如JU-A10、RE-7等。在此基础上,为进一步提高菌株分泌纤维素酶能力和对底物的降解能力,本论文综合已有知识,从多方面对草酸青霉进行了系统改造,通过重构调控网络增强菌株胞外纤维素酶分泌能力、通过调整酶系构成增强纤维素酶对底物的降解能力,进一步结合诱变筛选,获得了多株产酶能力和水解纤维素底物能力高的优良纤维素酶生产菌株。论文的主要研究内容和研究结果如下:1.草酸青霉纤维素酶系改造和调控网络重构,构建了一系列纤维素酶生产能力和对不同纤维素底物水解能力提高的优良菌株。以实验室已有的一株纤维素酶高产菌株RE-7为出发菌株,通过替换本源CBH为里氏木霉来源CBH、敲除bgl2同时过表达EG、黑曲霉来源BGL1和Swo(swollenin)等,筛选得到重组菌株TEBS-1和TEBS-2;通过替换CBH、敲除bgl2同时过表达BGL1、嵌合转录因子CXC,筛选得到TBgcB-2。结果表明,上述构建的重组菌株的胞外蛋白分泌量、FPA及各项主要纤维素酶活如纤维素内切酶酶活、纤维素外切酶酶活等都有显著提升,其中TBgcB-2的滤纸酶活达到了 9.89±1.04 IU/ml,是出发菌株RE-7粗酶液滤纸酶活的约2.15倍。利用TEBS-2粗酶液水解不同预处理后的玉米秸秆原料,包括APCS(亚硫酸铵预处理玉米秸秆)、NPCS(NaOH预处理玉米秸秆)、SPCS(稀硫酸预处理玉米秸秆)以及LHW(高温热水预处理玉米秸秆),水解48 h时纤维素转化率分别是出发菌株RE-7的1.5倍、1.67倍、1.48倍和1.57倍,表明重组菌株纤维素酶系的水解效率大幅度提高。基于上述研究结果和实验室前期已有研究基础,为减少筛选标记对遗传改造的限制,以实验室已有尿嘧啶缺陷型草酸青霉M12为出发株,敲除bgl2的同时过表达黑曲霉BGL1和嵌合转录因子CXC、敲除阻遏因子CreA同时过表达突变的转录激活因子xlnRA871v、敲除本源CBH同时过表达里氏木霉CBH,经过上述三步改造后,得到重组菌株CXT。研究表明,CXT粗酶液的滤纸酶活是RE-7的约2.39倍,纤维素外切酶、纤维素内切酶、β-葡萄糖苷酶酶活也都较RE-7有较大提高。胞外蛋白和酶活分析说明通过重构草酸青霉调控网络也有效地提高了工程菌株的蛋白分泌量。利用CXT粗酶液水解NPCS、SPCS和LHW等不同方法预处理后的玉米秸秆原料,结果表明,与菌株RE-7的粗酶液相比,对底物的水解效率显著提升,与商业纤维素酶相比,水解后葡聚糖转化率基本类似,显示了良好的应用前景。由于CXT菌株的滤纸酶活和水解能力都较高,并且只经过三步改造,可以作为后续继续对草酸青霉进行遗传操作改造的优质出发菌株。2.半纤维素相关降解酶类基因的表达及草酸青霉半纤维素酶系改造通过对糖化水解残渣进行分析,将CXT菌株中可能缺少的多个半纤维素酶组分在毕赤酵母中进行了表达,包括草酸青霉来源的内切-β-1,4-木聚糖酶、α-葡萄糖醛酸酶/β-氨基葡萄糖苷酶,黑曲霉来源的α-木糖苷酶,以及里氏木霉来源的α-葡萄糖醛酸酶,分离纯化得到纯酶组分并研究了各自的酶学性质。结合课题组已有半纤维素酶的研究,获得了 8种纯化的半纤维素酶类,分别研究了其添加对CXT粗酶液水解不同预处理玉米秸秆过程中葡聚糖转化率的影响。结果表明,其中,β-木糖苷酶Xyl3A、α-木糖苷酶、多功能酶Gax3A(同时具有β-葡萄糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和木糖苷酶酶酶活)的添加在一定程度上都对CXT粗酶液糖化能力有促进作用。原因可能是这三种酶组分的添加能够有效水解木寡糖,降低其对水解的抑制作用,其中,多功能酶Gax3A的添加还可以释放侧链阿拉伯糖基团,增加纤维素酶与底物的可及度从而增强草酸青霉的水解能力,提高葡萄糖产率。为进一步提升CXT菌株对底物的水解能力,以CXT为出发株,过表达β-木糖苷酶Xy13A,得到了重组菌株CXyl;在此基础上,共过表达α-木糖苷酶和多功能酶Gax3A,得到了重组菌株CxylAXG。与菌株CXT相比,CxylAXG粗酶液水解APCS时,72 h时的葡聚糖转化率为81.3%,提高了 22.8%。3.ARTP、ARTP-UV 诱变育种为进一步提高草酸青霉产酶能力,对本文构建得到的所有重组菌株进行ARTP、ARTP-UV诱变,经微晶纤维素平板初筛后,以正突变株发酵粗酶液的滤纸酶活作为标准进行复筛,得到了一系列更高酶活的诱变菌株,其中突变株CXTA-6和Cxyl3-9的发酵液的滤纸酶活分别为13.99±0.33 IU/ml和14.41± 0.33 IU/ml,是菌株RE-7的3.04倍和3.13倍。