研究目的随着女性社会生活的角色越来越重要,以及环境污染等因素,乳腺癌已经成为中国城市女性第一位的高发疾病(2017年国家癌症中心报告)。近年来对乳腺癌的临床及科研,乳腺癌可以得到更好的早期发现,在治疗上除了手术切除,还包括了放疗、化疗以及内分泌治疗,尤其是利用HER-2阳性的曲妥珠单抗靶向治疗,提高了患者的生存率。但是由于肿瘤的异质性和个体的特异性,上述的治疗方法,并未能解决一些复杂的疾病,而耐药也是亟待解决的问题。因此,基于精准治疗的目标,研究新型有效的靶向治疗方法迫在眉睫。Micro RNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约20~25个核苷酸。通过与靶标m RNA的3’非编码区(3’UTRs)的互补作用位点相结合,直接降解靶m RNA或抑制m RNA的翻译,从而参与到细胞的分化、发育、增殖、凋亡等生物学进程的调控。近年的研究表明miRNAs在肿瘤的发生发展中起到至关重要的作用,在乳腺癌中也不例外。Micro RNA-204(miR-204)现已被证实在胃癌、子宫内膜癌、乳腺癌中低表达,并且通过与靶基因结合,参与到相关细胞通路,进而影响肿瘤的发生发展。我们课题的前期研究表明,miR-204在乳腺癌中低表达,并且可以抑制MDA-MCF-7乳腺癌细胞株的增殖能力,促进凋亡并使细胞阻滞在G2/M期,并且抑制细胞的迁移和转移。为了更好了解miR-204在乳腺癌中的影响及相关机制,在此做进一步的研究。叉头框(forkhead box,FOX)蛋白家族是一类DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子,目前已有17个亚族。FOX家族中参与细胞凋亡和周期调控的最重要的一个亚群是FOXO亚族。本课题组前期研究发现FOXA1可以与靶向结合miR-204,但其具体机制不明。通过超过十个以上的miRNA的靶标预测软件预测,我们发现FOXO1同样与miR-204有可能结合位点。为了进一步研究该FOXO1是否可以同miR-204靶向结合,是否可以参与到乳腺癌的发生发展的调控中。课题组预通过体外实验、生物信息学分析等方法对其进行探讨。PI3K/AKT是与生命及肿瘤息息相关的细胞信号通路,PI3K/AKT/FOXO1通路已经被验证是参与到抑制凋亡的重要通路。FOXO1是PI3K/AKT通路下游的重要因子,我们通过研究这条通路上的相关的分子,探索miR-204是否能够靶向结合FOXO1,并通过凋亡相关通路AKT/FOXO1参与到乳腺癌的发生、发展过程中。材料与方法1第一部分miR-204和FOXO1在乳腺癌组织中的表达及临床意义1.1挖掘GEO(Gene Expression Omnibus)数据中的芯片数据集,整理分析miR-204在乳腺癌中的表达及临床意义。1.2挖掘TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中的相关表达数据,整理分析miR-204和FOXO1在乳腺癌中的表达及临床意义。1.3利用Oncomine数据库,获取FOXO1在乳腺癌中的表达数据。2第二部分miR-204对乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞的增殖、迁移、凋亡的影响2.1通过慢病毒转染技术构建并筛选过表达miR-204的MDA-MB-231细胞株。2.2利用MTT检测miR-204对MDA-MB-231细胞株的增殖影响,用划痕检测miR-204对MDA-MB-231细胞株的迁移影响,流式细胞技术检测miR-204对MDA-MB-231细胞株的周期和凋亡的影响。3第三部分miR-204对FOXO1的靶向作用,与AKT/JNK/FOXO1凋亡通路的关系3.1 q RT-PCR检测过表达miR-204的MDA-MB-231细胞株中FOXO1基因m RNA的表达情况,利用Western Blot(WB)测定FOXO1在上述细胞株中的蛋白表达情况。3.2双荧光素酶报告基因实验明确miR-204对FOXO1的靶向关系。3.3 WB检测过表达miR-204的MDA-MB-231细胞株中AKT/FOXO1凋亡通路上的相关蛋白表达情况,明确miR-204与通路的关系。研究结果1第一部分miR-204和FOXO1在乳腺癌组织中表达异常,并且二者都与乳腺癌的部分临床病理参数相关。2第二部分在MDA-MB-231乳腺癌细胞株过表达miR-204,能够促进细胞增殖,抑制细胞迁移及凋亡。3第三部分miR-204能够和FOXO1直接靶向结合,并且可能与调节AKT/FOXO1通路相关,抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞株的凋亡。研究结果1第一部分miR-204和FOXO1均与乳腺癌的发生发展密切相关。2第二部分过表达miR-204可以影响乳腺癌细胞的生物学行为。3第三部分miR-204通过靶向结合FOXO1,激活AKT/FOXO1通路,抑制乳腺癌细胞凋亡。