第一部分:MicroRNA-485-5p在NSCLC中通过靶向调控IGF2BP2抑制细胞增殖和侵袭研究背景:非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌总数的80%-85%。远处转移是引起肿瘤患者死亡的最主要原因。上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指细胞失去上皮细胞特征并获得间质细胞表型的一种生物学过程,与上皮癌细胞迁移和侵袭能力变强密切相关。转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)是一个 EMT 的诱导因子。鉴定 EMT 的关键性调控基因对于建立有效的抗肿瘤转移的方法具有重要意义。microRNAs(miRs)是一类内源性的、非编码小RNA,可与靶基因3’-非翻译区(3’-untranslatedregions,3’-UTR)结合,导致mRNA降解或翻译抑制。有文献报道,miR-485-5p的表达水平在NSCLC癌患者与健康对照者之间差别很大,具有诊断的价值。然而,miR-485-5p在NSCLC中的预后意义和生物学功能尚不清楚。研究目的:本部分拟阐明miR-485-5p的表达水平在NSCLC中的临床意义并揭示miR-485-5p在肿瘤生长和转移中的作用和分子机制。材料和方法:本研究共收集87例NSCLC和癌旁非肿瘤肺组织。所有病例均经病理检查证实。术前无患者接受放疗或化疗。利用Trizol试剂从石蜡包埋的组织样本中提取RNA。利用专门针对miR-485-5p的茎环引物进行反转录,利用TaqMan microRNA Assay kit分析试剂盒进行实时定量PCR检测miR-485-5p的表达水平。采用逆转录 PCR 法扩增 MDM4、NUCB1、DEFA、IGF2BP2 和 MMP14 3’-UTR 片段,并将其克隆到pMIR报告萤火虫荧光素酶载体中。通过PCR扩增全长IGF2BP2和miR-485-5p前体的基因片段,并将其克隆到pcDNA3.1(+)载体中。利用脂质体转染试剂将特定质粒转染至NSCLC细胞,应用800μg/mL的G418筛选2周获得稳定转染细胞株。接种细胞至96孔板,在含10%胎牛血清的完全培养基下培养1～5天,应用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况。应用Transwell侵袭试验检测细胞侵袭能力。应用70%乙醇固定细胞,用50μg/mL碘化丙啶染色液孵育细胞,应用流式细胞仪分析细胞周期分布。细胞与5ng/mL的TGF-β孵育48小时,在相差显微镜下观察细胞形态,应用蛋白免疫印迹法检测E-cadherin和vimentin的表达情况。应用脂质体3000把3’-UTR报告质粒与miR-485-5pmimic或对照寡核苷酸共转染HEK293T细胞。转染编码海肾荧光素酶的PRL-TK载体用于监测细胞转染效率.。转染48小时后用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。将稳定表达miR-485-5p或对照miR的A549细胞植入雄性BALB/c裸鼠皮下(2X106个细胞/鼠,n = 5)。每周测量肿瘤体积,监测肿瘤生长情况。细胞植入后4周处死小鼠,切除移植瘤并称重。用蛋白免疫印迹法检测肿瘤组织中IGF2BP2蛋白的表达。将稳定表达miR-485-5p或对照miR的A549细胞(2×106细胞/小鼠,n = 4)经尾静脉注入裸鼠体内。7周后处死动物,取肺组织进行病理检查。测定肺内微小转移结节的数目。平均数据采用Student’s t-test检验或单因素方差分析,后用posthocTukey’s检验。采用Mann-WhitneyU检验比较癌组织与非癌组织miR-485-5p的平均水平。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,log-rank检验法测定差异。P<0.05。结果:NSCLC组织中miR-485-5p表达水平明显低于癌旁肺组织。miR-485-5p低表达与晚期肿瘤分期(P = 0.0216)和淋巴结转移(P = 0.0037)具有显著相关。miR-485-5p低表达组总生存率(P = 0.0136)和无病生存率(P = 0.0085)明显低于高表达miR-485-5p组。在体外过表达miR-485-5p抑制NSCLC细胞(NSCLC)生长和侵袭并逆转上皮间充质转化。与正常人支气管上皮BEAS-2B细胞相比,NSCLC细胞(A549、NCI-H460 和 NCI-H1299)的 miR-485-5p 表达显著降低(P<0.05)。过表达miR-485-5p可显著降低A549和NCI-H1299细胞的增殖能力和侵袭能力(P<0.05)。培养72h后,miR-485-5p能够显著抑制A549和NCI-H1299细胞的增殖,分别抑制74%和56%。miR-485-5p过表达促进A549细胞G0/G1期阻滞,阻断TGF-β诱导的上皮间充质转化。相反,抑制miR-485-5p则可促进细胞增殖和侵袭能力。miR-485-5p过表达显著降低IGF2BP2 3 ’-UTR诱导的荧光素酶报告活性(P<0.05),而对MDM4、NUCB1、DEFA和MMP14的3’-UTRs报告基因的活性没有显著影响。过表达miR-485-5p导致A549和NCI-H1299细胞中内源性IGF2BP2的表达明显下调。A549细胞过表达IGF2BP2能够逆转miR-485-5p介导的生长抑制和侵袭作用。沉默IGF2BP2引起A549细胞增殖和侵袭能力下降。体内实验表明,过表达miR-485-5p能够明显抑制A549移植瘤的生长,最终肿瘤重量为对照组的30%(P<0.05)。miR-485-5p高表达组IGF2BP2表达水平明显降低(P<0.05)。并且,miR-485-5p过表达显著降低肺转移的能力(P<0.05)。结论:miR-485-5p下调预测NSCLC预后不良,其过表达通过抑制IGF2BP2阻断NSCLC细胞的生长和侵袭。第二部分:MicroRNA-381通过NF-κ B信号通路抑制NSCLC生长并增加顺铂敏感性研究背景:尽管在过去几十年里治疗方面有所改善,非小细胞肺癌(NSCLC)的5年总生存率仍很低。由于出现耐药性,化疗的疗效受到很大的限制。microRNA(miRs)作为内源性非编码小RNA参与调节NSCLC细胞对顺铂的化疗敏感性。miR-381在人肺腺癌中表达下调,而miR-381过表达通过抑制分化抑制因子1(ID1)显著减少细胞的迁移和侵袭。然而,miR-381在NSCLC细胞生长和存活中的作用尚不清楚。研究目的:本研究旨在确定miR-381对NSCLC细胞增殖和凋亡的调控作用,并探讨其对顺铂敏感性的影响和分子机制。材料和方法:耐顺铂的A549细胞(A549/CDDP)是通过暴露在浓度逐步增加(0.5,1,2,4和10 μ M)的顺铂中获得。A549细胞暴露于0.5 μM顺铂3天恢复4天。这种治疗在每种顺铂浓度下重复一次。然后将细胞随着顺铂达10 μM。顺铂耐药细胞保持在添加4μ M浓度的顺铂的培养基中进行培养。利用脂质体将miR-381前体表达质粒和阴性对照质粒转染至A549和NCI-H460细胞中,然后加入G418(800微克/毫升)筛选2周获得稳定转染细胞株。细胞接种于密度为5×103细胞/每孔的96孔板中。在培养24～72小时后,收集细胞,通过MTT法测定细胞活性。对顺铂的毒性实验,转染不同质粒的A549/CDDP细胞分别暴露于不同浓度的顺铂0～40μ M,48小时后,采用MTT法检测细胞活力,测算顺铂半数抑制浓度(IC50)。细胞接种于6孔板,细胞的浓度为600细胞/孔,孵育2周后,用结晶紫染色,计数由>50个细胞组成的菌落数。细胞用70%乙醇固定,应用50μg/ml碘化丙啶染色,使用流式细胞仪进行进行细胞周期分析。转染48小时后收集细胞,并用70%乙醇固定细胞,并用异硫氰酸荧光素标记的Annexin-V和PI共同染色标记。应用流式细胞术分析细胞凋亡情况。利用荧光素酶报告基因测定依赖NF-K B的转录活性。共转染NF-K B-luc报告质粒、pRL-CMV表达质粒和miR-381或对照miRNA。48小时后,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的活性。采用Trizol试剂提取总细胞RNA,进行反转录,然后采用TaqManmiRNA检测系统对miR-381进行实时PCR分析。细胞裂解,裂解缓冲液含有蛋白酶抑制剂,通过离心分离沉淀。上清液作为细胞质提取物收集。该沉淀悬浮在核提取液,并在冰上放置30分钟和13000 g离心15分钟,上清液作为核提取物。蛋白提取物行免疫印迹实验检测目的蛋白的表达情况。稳定表达miR-381或对照miR的A549细胞(2× 106个细胞/只)皮下注射雄性BALB/c裸鼠(每组5只裸鼠)。每周测量肿瘤体积,共测量4周,并绘制肿瘤生长曲线。每个样品三个复孔,重复至少三次。所有数据均为平均数±标准差和Student’s t检验和单因素方差分析和Tukey多重比较检验分析。P<0.05被认为具有统计学意义。结果:MTT法显示,与转染对照的miR-NC的细胞相比,转染miR-381前体能够显著(P<0.05)抑制A549和NCI-H460细胞的增殖。过表达miR-381导致集落形成能力下降约80%。体内致瘤实验进一步证实miR-381过表达延迟了 A549异种移植肿瘤的体内生长。与转染对照的miR-的NSCLC细胞相比,过表达miR-381导致细胞在G0/G1期的百分比显著增加,并且在S期的细胞百分比显著降低(P<0.05)。蛋白印迹分析证实过表达miR-381的A549和NCI-H460细胞中p21和p27的蛋白水平的水平显著高于(P<0.05)转染对照miR的对应细胞中的水平,而细胞周期蛋白D1和CDK4的水平则显著低于(P<0.05)转染对照miR的对应细胞中的水平。与A549亲代细胞相比,顺铂抗性的对应物(A549/CDDP)中miR-381的水平显著减低,miR-381在顺铂抗性的对应物(A549/CDDP)中的水平较对照组miR中低大约2.8倍(P<0.05)。过表达miR-381使A549/CDDP细胞对顺铂更敏感,IC50值降低了 6倍。过表达miR-381显著诱导A549/CDDP细胞发生凋亡,使凋亡率从对照组的7.4±1.4%增加到28.2±2.1%(P<0.05)。恢复miR-381的表达降低了 NF-κ Bp65在细胞核内的积累,增加了亲代和顺铂耐药的A549细胞中Iκ Bα的水平。与转染对照miR的细胞相比,过表达miR-381导致依赖NF-κ Bp65的转录活性显著下降,并降低了 Bcl-2和Bcl-XL的表达(P<0.05)。ID1的过表达恢复了 NF-K B p65的核转位,并增加了 miR-381过表达的A549细胞中Bcl-2和Bcl-XL的表达水平。过表达ID1(P<0.05)恢复了过表达miR-381的A549细胞的生长。在A549/CDDP细胞中,ID1的共表达几乎完全阻止了过表达miR-381诱导的A549细胞对顺铂的IC50值的降低。此外,通过过量表达ID1显著地消除了 miR-381介导的凋亡。结论:miR-381过表达抑制NSCLC细胞增殖和肿瘤发生,并增加NSCLC细胞对顺铂的敏感性。通过下调ID1表达,抑制NF-K B信号,miR-381发挥抑制肿瘤活性的作用。恢复miR-381可能为NSCLC的潜在治疗方法。