目的肝癌(Hepatocellular carcinoma)是仅次于肺癌的世界第二大致死性癌症,成为危害人类健康的主要疾病之一。肝细胞肝癌是一种典型的炎症相关性肿瘤,通常由慢性的肝炎患者发展而来,慢性炎症的炎症微环境与肝癌发生发展密切相关。陈列平教授提出肿瘤免疫逃逸的"适应性抵抗假说",假说指出,肿瘤细胞针对免疫反应,产生了一个适应自身生存的微环境。肿瘤的产生是几年甚至数十年的漫长过程,或许肿瘤组织已经将微环境对肿瘤细胞的免疫反应改造为适应于肿瘤细胞生长的机制。肿瘤组织浸润的T淋巴细胞分泌细胞因子例如,IFN-γ,IFN-γ作用于免疫细胞可以增强免疫细胞的活性,从而杀伤肿瘤细胞,但同时IFN-γ也可以使肿瘤细胞B7-H1分子表达增加,表达于肿瘤细胞表面的B7-H1分子与T细胞表面的受体PD-1结合,PD-1是表达在T细胞表面的一种重要的免疫抑制性蛋白,B7-H1与PD-1结合可以抑制T细胞的活化和细胞因子的产生,导致T细胞功能的耗竭,促进肿瘤细胞的免疫逃逸。随着免疫疗法的不断发展进步,特别是近几年免疫检查点疗法的迅速发展,人类对于肿瘤的治疗取得了很大进步。最新一代的免疫检查点抑制剂通过阻断淋巴细胞上PD1与抗原呈递细胞或者肿瘤细胞上的B7-H1分子的相互作用而发挥治疗效果。FDA已经批准B7-H1药物应用于临床治疗非小细胞肺癌和膀胱癌,其余适应症正在临床实验阶段。肿瘤微环境(Tumor Microenviroment,TME)是肿瘤细胞赖以生存的复杂环境,主要由多种细胞和蛋白质组成,不仅起支架作用还含有大量的细胞因子。B7-H1的表达受多种细胞因子的影响,例如IFN-γ、TNF-α、IL-4和VEGF等,在肝癌的肿瘤微环境中含有大量的细胞因子,IFN-γ和TNF-α是其中两种最主要的细胞因子。那么,我们推测在肿瘤微环境中IFN-γ是否能引起肝癌细胞B7-H1分子的表达?TNF-α是否能引起肝癌细胞B7-H1分子的升高?二者在促进B7-H1升高中有怎样的联系?以及表达增加的B7-H1分子是否具有免疫抵抗功能?针对上述问题我们进行了如下研究,本课题首先研究了 IFN-γ可以诱导肝癌细胞表达B7-H1分子,以及主要通过的信号通路是JAK/STAT1信号通路。并且发现TNF-α与IFN-γ可以协同促进B7-H1分子的表达。进一步研究协同促进作用的机制,研究发现TNF-α通过NF-κB信号通路促进IFNGR1、IFNGR2的表达,进而增强IFN-γ信号通路的活化,导致肝癌细胞B7-H1分子的表达增加。为了进一步研究TNF-α和IFN-γ诱导表达的B7-H1分子是否具有免疫抵抗功能,我们进行了 T细胞与肿瘤细胞的共培养实验和动物实验,实验结果表明协同诱导的B7-H1分子能抑制T细胞的增殖,促进肿瘤细胞的免疫逃逸。所以TNF-α和IFN-γ诱导表达的B7-H1分子具有免疫抵抗作用。方法一、IFN-γ诱导肝癌细胞表达B7-H1分子(一)B7-H1分子的表达对于IFN-γ有浓度和时间的依赖性肝癌细胞SMMC-7721种板贴壁后,采用不同浓度的IFN-γ诱导B7-H1的表达,将储存液浓度为100ng/μl的IFN-γ进行稀释,使其作用浓度分别为100ng/ml、50 ng/ml、20 ng/ml、10 ng/ml,诱导细胞 24h 后收 RNA,RT-PCR 检测 B7-H1 RNA水平的表达情况。进一步检测在相同浓度的IFN-γ(50 ng/ml)诱导下,B7-H1表达随时间的变化,分别诱导0、1、2、3、6、12、24h采用RT-PCR以及qPCR的方法检测B7-H1分子的表达情况。(二)IFN-γ诱导肝癌细胞B7-H1分子在RNA以及蛋白水平的表达本实验所用的肝癌细胞系SMMC-7721、HLE-7402、HuH-7和Hep3B均购于中国科学院上海细胞库,这四种肝癌细胞均在50 ng/ml IFN-γ诱导6h的条件下采用RT-PCR方法检测B7-H1 RNA水平的表达。我们选择其中两种细胞系SMMC-7721和HuH-7进行后续实验,在50 ng/ml IFN-γ诱导6h的条件下用qPCR方法进一步检测B7-H1 RNA水平的表达。采用50ng/ml IFN-γ诱导24h后,用PBS清洗一次去除死亡细胞,再用胰酶将细胞消化成单个细胞,清洗去除胰酶,再标记人B7-H1的流式抗体,同时采用同型抗体去除非特异性着色,运用流式细胞术方法检测B7-H1蛋白水平的表达。二、IFN-γ诱导肝癌细胞B7-H1分子表达主要通过的信号通路首先检测IFN-γ诱导肝癌细胞表达B7-H1分子涉及的信号通路。将SMMC-7721细胞种板贴壁后再加入IFN-γ(50ng/ml),分别诱导0、5、15、30、60min,Western-blot 方法检测 p-STAT1、p-AKT、p-P65、p-P38、p-MEK 和 p-JNK的活化情况。根据检测到的IFN-γ诱导肝癌细胞表达B7-H1分子涉及的信号通路购买信号通路的抑制剂。Western-blot方法显示涉及的信号通路有NF-κB、PI3K、MEK、JNK、P38、JAK/STAT1。首先采用Western-blot方法检测各种抑制剂(BAY11-7082(NF-κB)、LY294002(PI3Kα/δ/β)、U0126(MEK1/2),、SP600125(JNK1/2/3)、SB202190(p38α/β)、Ruxolitinib(JAK1/2))对于对应信号通路的抑制效果以及最适抑制浓度。将SMMC-7721细胞种板贴壁后,提前采用最适浓度抑制剂处理1h,再加入IFN-γ(50ng/ml)同时含有新抑制剂,37℃,培养15min,加入蛋白裂解液收细胞蛋白,采用Western-blot的方法检测最适抑制剂浓度。检测IFN-γ诱导肝癌细胞B7-H1分子主要通过的信号通路。将SMMC-7721细胞种板贴壁后,提前运用最适浓度的抑制剂处理1h,再加入IFN-γ(50ng/ml)同时含有新抑制剂,37℃,诱导细胞6h用qPCR方法检测B7-H1的表达情况。进一步采用小干扰确证IFN-γ诱导肝癌细胞B7-H1分子表达主要通过JAK/STAT1信号通路。所以合成JAK/STAT1信号通路中两个重要的转录因子STAT1和IRF1的小干扰。首先验证小干扰的干扰效果,SMMC-7721细胞种板贴壁,第二天大约生长至70%进行转染,转染24h后收RNA,RT-PCR的方法检测STAT1和IRF1的表达水平,选择干扰效果好的进行后续实验。SMMC-7721细胞种板转染STAT1和IRF1小干扰,24h后加IFN-γ(50 ng/ml)诱导细胞6h,qPCR检测B7-H1 RNA水平的变化。三、TNF-α与IFN-γ协同诱导肝癌细胞表达B7-H1分子SMMC-7721 或 HuH-7 细胞种板贴壁后,分别用 TNF-α(50ng/ml)、IFN-γ(5ng/ml)或者二者同时诱导细胞,6h后收RNA,采用qPCR方法检测在RNA水平B7-H1分子的表达变化情况。诱导24h后采用流式细胞术的方法检测蛋白水平的变化。四、TNF-α与IFN-γ协同诱导肝癌细胞表达B7-H1分子的机制(一)分析TNF-α对于IFN-γ信号通路的作用运用各种信号通路的抑制剂检测TNF-α与IFN-γ协同诱导B7-H1表达过程中信号通路的变化。先将SMMC-7721细胞或HuH-7细胞种板贴壁后用抑制剂处理,37℃,1h,抑制信号通路的活性,再用TNF-α(50ng/ml)和IFN-γ(5ng/ml)同时含有抑制剂的培养基诱导细胞,6h后收细胞的RNA,运用qPCR方法检测B7-H1分子的表达变化情况。为了进一步验证信号通路的变化,我们运用信号通路的小干扰RNA,siSTAT1、siIRF1、siP65、sic-JUN、sic-FOS 和 siATF2,12 孔板,转染小干扰RNA24h 后加 TNF-α(50ng/ml)和IFN-γ(5ng/ml)诱导细胞,6h 后收 RNA,运用qPCR方法检测B7-H1分子的变化情况。将种板贴壁后的细胞用TNF-α(50ng/ml)和IFN-γ(5ng/ml)培养基诱导细胞表达B7-H1分子,24h后收细胞蛋白,用Western-blot方法检测蛋白水平JAK/STAT1信号通路中JAK2以及p-JAK2、STAT1以及p-STAT1的变化情况。(二)TNF-α对于IFNGR1、IFNGR2表达的影响检测JAK/STAT1信号通路上游分子IFNGR1、IFNGR2的变化情况。将种板贴壁后的细胞分别用TNF-α(50ng/ml)、IFN-γ(5ng/ml)或者二者同时诱导细胞表达B7-H1分子,6h后收细胞的RNA,qPCR的方法检测IFNGR1、IFNGR2表达的变化。为了进一步研究TNF-α增强IFNGR1、IFNGR2表达的机制。首先查阅文献TNF-α主要的信号通路有NF-κB、MEK、P38、JNK等,运用这些信号通路的抑制剂抑制细胞,将SMMC-7721细胞或HuH-7细胞种板贴壁后提前1h加抑制剂处理(5μM BAY11-7082(NF-κB)、5μM U0126(MEK1/2)、5μM SB202190(p38α/β)、5μM SP600125(JNK1/2/3)),再运用 TNF-α(50ng/ml)诱导 6h,qPCR 的方法检测IFNGR1、IFNGR2表达的变化。为了进一步确证TNF-α是通过NF-κB信号通路增强IFNGR1、IFNGR2的表达,运用小干扰试验进行验证。将SMMC-7721细胞或HuH-7细胞种板贴壁后转染 siP65,24h 后再用 TNF-α(50ng/ml)诱导 6h,qPCR 的方法检测 IFNGR1、IFNGR2表达的变化。五、TNF-α与IFN-γ协同诱导肝癌细胞表达的B7-H1分子具有免疫抵抗功能为了验证TNF-α与IFN-γ协同诱导肝癌细胞表达的B7-H1分子是否具有免疫抵抗功能,我们进行了肿瘤细胞与T细胞的共培养实验以及动物实验。(一)小鼠肿瘤细胞与T细胞共培养实验1.TNF-α与IFN-γ协同诱导小鼠肝癌细胞表达B7-H1分子小鼠肝癌细胞Hepa1-6贴壁后,采用IFN-γ、TNF-α或者IFN-γ和TNF-α同时诱导细胞表达B7-H1分子,诱导6h后,收细胞RNA,qPCR方法检测Hepa1-6细胞表面B7-H1分子RNA水平表达的变化情况。细胞因子诱导Hepa1-6细胞24h,用PBS清洗一次去除死亡细胞,再用胰酶将细胞消化成单个细胞,清洗去除胰酶,标记小鼠B7-H1流式抗体,检测B7-H1蛋白水平的变化。2.肿瘤细胞种板和转染合成小鼠B7-H1的小干扰,首先检测小干扰的效果。Hepa1-6细胞种板,12孔板,每孔1.8×105个细胞,第二天细胞生长至70%进行转染小鼠B7-H1小干扰。转染24h,qPCR检测RNA水平的变化。转染48h,Western-blot检测蛋白水平的变化。第一天下午小鼠Hepa1-6种板,12孔板每孔1.8×105个。第二天上午生长至70%左右进行转染小鼠B7-H1。3.肿瘤细胞用IFN-γ和TNF-α处理IFN-γ储存浓度为50ng/μl,作用浓度为5ng/ml,取2μl储存液溶于18μl的T细胞培养基中,稀释后浓度为5ng/μl,则每1ml培养基中加1μl IFN-γ稀释液。TNF-α储存浓度为100ng/μl,作用浓度为50ng/ml,取8μl储存液溶于72μl的T细胞培养基中,稀释后浓度为10ng/μl,则每1ml培养基中加5μl TNF-α稀释液。上述Hepa1-6细胞种板转,6h换液同时加IFN-γ和TNF-α处理。4.将肿瘤细胞用mitomycinC处理第三天上午,将肿瘤细胞用mitomycinC处理,mitomycinC粉末5mg,加747.65μl DMSO稀释后浓度为20mM,即6.687μg/μl。设置浓度梯度确定最适宜mitomycinC处理的作用浓度,将最适浓度的mitomycinC加入上述转染且已用IFN-γ和TNF-α处理的肿瘤细胞培养板中,静置37℃,30min,清洗三次去除残留的 mitomycinC。5.取小鼠单个核细胞第三天上午取SPF级的6-8W周C57BL/6J小鼠,脱颈处死置于75%酒精中浸泡5min,超净工作台中取小鼠脾脏组织,取出后在PBS中清洗2遍。置于70μM的过滤器上先用剪刀剪碎再用5ml针栓研磨,细胞悬液转移到10ml离心管中,离心1000rpm,5min,用3ml Tris-NH4Cl重悬沉淀裂解红细胞,静置3min。加5ml培养基阻止裂红,1000rpm,5min。用2mlT细胞培养基重悬,取1ml溶于9ml中进行10倍稀释,计数。6.CFSE染色CFSE每管粉末50μg,分子量为557.47,每管加18ulDMSO,则悬液的浓度为5mM。设置浓度梯度选择较好的CFSE作用浓度。12孔板每孔需单个核细胞1.6×106个,按所需的细胞数计算所需T细胞悬液的量,离心,1000r/min,5min。用最适浓度的CFSE溶液重悬细胞,室温静置7min,加5倍体积含有血清的培养基冰上静置5min。用大量含血清培养基清洗三次,最后用T细胞培养基重悬细胞沉淀。设置浓度梯度选择适宜的ConA作用浓度,根据每孔需要T细胞、IFN-γ、TNF-α以及ConA配成细胞悬液,加入到用mitomycinC处理的肿瘤细胞孔中进行共培养。共培养第二天,每孔各加1ml T细胞培养基,培养基中是否需要IFN-γ、TNF-α以及ConA都与前述孔中液体相同。7.流式细胞术检测共培养72h,采用流式细胞术方法检测T细胞的增殖情况。将12孔板中的细胞悬液加入到对应流式管中,用PBS清洗一次将清洗的PBS也加入到对应管中。用胰酶消化残留细胞,将细胞全部转移到对应的流式管中,1000r/min,5min。用50μl含0.5%血清的PBS重悬。标记CD3抗体4℃,45min。每管加3ml含0.5%血清的PBS清洗一次,1000r/min,5min。用300μl含0.5%血清的PBS重悬,用400目铜网进行过滤,流式细胞术检测B7-H1分子在蛋白水平表达的情况。(二)动物实验1.小鼠肝癌细胞系的准备选择状态较好的小鼠肝癌细胞hepa1-6,将hepa1-6细胞大量扩增。2.皮下成瘤将瓶中的细胞用胰酶消化成单个细胞,调整浓度大约4×106个/ml,选择SPF级的6-8W周C57BL/6J小鼠,每只小鼠腹部皮下注射100μl细胞悬液,观察肿瘤的生长情况。根据肿瘤大小将小鼠平均分为3组,A组注射siNC,B组注射siNC、IFN-γ和 TNF-α,C 组注射 siB7-H1、IFN-γ 和 TNF-α。3.注射小干扰RNA和细胞因子第一天将粉末小干扰RNA用DEPC水溶解,每只小鼠大约10μg siRNA。运用专用体内转染试剂polyplus in vivo-jetPEI进行瘤内注射。第二天瘤内注射细胞因子TNF-α0.5μg/只,IFN-γ0.05μg/只,小干扰和细胞因子每三天注射一次,小干扰和细胞因子共注射四次。4.肿瘤体积的测量第三天测量肿瘤体积,整个过程肿瘤体积测量六次。结果一、IFN-γ诱导肝癌细胞表达B7-H1分子为了检测IFN-γ是否能诱导肝癌细胞系B7-H1分子的表达,运用肝癌细胞系SMMC-7721在不同浓度IFN-γ诱导条件下检测B7-H1的表达情况。结果显示在采用不同浓度IFN-γ诱导条件下所表达的B7-H1分子的强度不同,随着IFN-γ浓度增加B7-H1分子的表达量增加,但是IFN-γ到达一定浓度时B7-H1分子的表达强度不再增加,同时结果显示50ng/ml的IFN-γ是引起B7-H1表达的最适浓度。相同浓度的IFN-γ(50ng/ml)诱导不同时间所表达的B7-H1分子的强度也不同,在0-6h随着时间延长B7-H1分子的表达量增强,6h之后随着时间延长B7-H1分子的表达降低。为了进一步确认上述现象,我们又在另外几种肝癌细胞SMMC-7721、HLE-7402、HuH-7、Hep3B中进行了上述实验。结果显示IFN-γ均可以诱导上述几种肝癌细胞B7-H1分子在RNA水平的表达。又进一步运用流式细胞术的方法检测IFN-γ是否可以诱导肝癌细胞B7-H1分子在蛋白水平的表达,结果显示在SMMC-7721和HuH-7细胞中,IFN-γ均可以诱导B7-H1分子在蛋白水平的表达二、IFN-γ诱导肝癌细胞B7-H1的表达主要通过JAK/STAT1信号通路。用Western-blot方法检测到IFN-γ诱导肝癌细胞表达B7-H1分子涉及多种信号通路。进一步用Western-blot方法检测各种抑制剂的最适抑制浓度,在IFN-γ诱导的基础上运用最适浓度的抑制剂,结果显示多条信号通路对于IFN-γ诱导的B7-H1的表达都有影响,但起主要作用的是JAK/STAT1信号通路。转染JAK/STAT1信号通路中主要的转录因子STAT1和IRF1的小干扰后,再用IFN-γ诱导,结果显示B7-H1的表达明显降低,验证了上述结论JAK/STAT1信号通路在这个过程中起主要作用。三、TNF-α与IFN-γ协同诱导肝癌细胞B7-H1分子的表达在SMMC-7721细胞和HuH-7细胞中采用TNF-α、IFN-γ或者二者同时诱导细胞表达B7-H1分子,研究发现,二者同时诱导比单用TNF-α或者IFN-γ时B7-H1分子在RNA水平以及蛋白水平的表达都有明显升高。所以,TNF-α和IFN-γ在诱导肝癌细胞B7-H1表达过程中二者具有明显的协同促进作用。四、TNF-α与IFN-γ协同诱导肝癌细胞表达B7-H1分子的机制为了研究二者协同诱导肝癌细胞表达B7-H1分子过程中主要的信号通路,运用抑制剂抑制信号通路的活化,同时运用TNF-α、IFN-γ诱导细胞表达B7-H1分子。结果显示,在二者协调诱导B7-H1分子表达过程中起主要作用的信号通路还是JAK/STAT1信号通路。为了进一步验证JAK/STAT1信号通路的作用,运用信号通路的小干扰RNA,发现运用siSTAT1、siIRF1的小干扰后B7-H1下降较明显与抑制剂的效果一致。进一步检测JAK/STAT1信号通路蛋白水平的变化,发现在蛋白水平JAK2、STAT1磷酸化水平增加,即这条信号通路的活化增强。又检测这条信号通路的上游分子IFNGR1、IFNGR2的表达情况,qPCR检测发现TNF-α均能使IFNGR1、IFNGR2的表达增加。为了进一步探讨TNF-α怎样增强IFNGR1、IFNGR2的表达。与前述相同运用信号通路的抑制剂以及小干扰RNA,检测在只用TNF-α刺激时IFNGR1、IFNGR2的变化,结果显示运用NF-κB的抑制剂以及小干扰RNA之后,IFNGR1、IFNGR2的表达明显降低。即TNF-α通过NF-κB信号通路增强IFNGR1、IFNGR2的表达。五、TNF-α与IFN-γ协同诱导肝癌细胞表达的B7-H1分子具有免疫抵抗作用实验结果显示小鼠肝癌细胞Hepa1-6可以被TNF-α、IFN-γ诱导表达B7-H1分子,而且TNF-α和IFN-γ对于B7-H1的表达具有协同促进作用。将小鼠的肿瘤细胞用TNF-α和IFN-γ处理使B7-H1分子表达增加,再将肿瘤细胞与T细胞共培养,与未用TNF-α和IFN-γ处理的对照组相比,流式细胞术结果显示CD3+的细胞中CFSE的平均荧光强度增强,即T细胞的增殖减弱,所以T细胞的增殖受到抑制。将小鼠的肿瘤细胞运用B7-H1的小干扰处理,再用TNF-α、IFN-γ诱导,流式细胞术结果显示CD3+的细胞中CFSE的平均荧光强度降低,T细胞增殖基本与对照组一致。实验结果显示TNF-α与IFN-γ协同诱导肝癌细胞表达的B7-H1分子能抑制T细胞的增殖。动物实验结果显示,A组注射NC小干扰,B组注射NC小干扰并且注射TNF-α和IFN-γ,C组注射B7-H1小干扰并且注射TNF-α和IFN-γ,所以B组B7-H1的表达最强,六次肿瘤体积测量的统计图显示,B组肿瘤体积比A、C组大,并且有统计学差异。动物实验结果显示,TNF-α与IFN-γ协同诱导表达的B7-H1分子具有功能,能促进肿瘤细胞的免疫逃逸。结论一、IFN-γ主要通过JAK/STAT1信号通路诱导肝癌细胞B7-H1分子的表达二、TNF-α与IFN--γ协同诱导肝癌细胞B7-H1分子的表达三、TNF-α通过NF-κB信号通路增强IFNGR1、IFNGR2的表达,促进IFN-γ信号通路的活化四、TNF-α与IFN-γ协同诱导肝癌细胞表达的B7-H1分子具有免疫抵抗作用