论文部分内容阅读
目的：1、建立大鼠腹部异位心脏移植模型及原位肝脏移植模型；2、建立体外培养、扩增大鼠骨髓源性未成熟树突状细胞(immature dendritic cells，imDc)的方法；3、建立补骨脂素联合长波紫外线照射(PUVA)诱导大鼠脾细胞凋亡的方法，观察imDC吞噬同种PUVA脾细胞(PUVA-SP)的能力以及吞噬后DC生物免疫学特性的变化；4、观察移植术前输注负载供者PUVA-SP的受者imDC(PUVA-SP-DC)对大鼠移植心脏存活的影响，探讨PUVA-SP-DC对移植免疫调节的可能作用机制。方法：1、采用腹腔双血管端侧吻合法建立大鼠腹部异位心脏移植模型；采用改良的二袖套法建立大鼠原位肝脏移植模型；2、体外分离大鼠骨髓前体细胞，在重组大鼠GM-CSF和IL-4的刺激下，培养扩增大鼠骨髓来源imDC，显微镜下观察DC的生长状态，流式细胞仪检测细胞表面分子表达；3、采用PUVA的方法，诱导大鼠脾细胞凋亡，通过流式细胞仪(FCM)检测凋亡的诱导情况，将供者凋亡脾细胞(PUVA-SP)与受者imDC共同培养，应用荧光显微镜，观察DC吞噬同种凋亡细胞的能力，通过FCM检测DC表面分子表达的变化情况，通过混合淋巴细胞反应了解PUVA-SP-DC刺激受者T细胞增殖的能力；4、以DA大鼠为供者、LEW大鼠为受者，心脏移植术前4天经舌下静脉输注不同的细胞。根据输注细胞的不同将实验大鼠分为5组：①Control组：单纯输注PBS；②DC组：输注受者DC细胞；③SP-DC组：输注负载供者脾细胞(SP)的受者DC；④PUVA-SP组：输注供者PUVA处理的脾细胞；⑤PUVA-SP-DC组：输注负载供者PUVA-SP的受者DC。观察各组小鼠移植心脏的存活时间和组织病理学改变，检测受者血清中细胞因子表达及外周血淋巴细胞Foxp3表达状况。结果：1、成功建立了稳定的大鼠腹部异位心脏移植模型和原位肝脏移植模型；2、在GM-CSF和IL-4的刺激下，可从大鼠骨髓培养扩增大量的imDC，在形态上表现为未成熟状态，细胞表面CD80、CD86、OX-6表达较低；3、脾细胞经PUVA处理后，继续培养过夜，可获得70％的凋亡脾细胞；4、荧光显微镜观察显示imDC可有效吞噬同种PUVA脾细胞，吞噬后并不刺激DC的成熟；5、混合淋巴细胞反应显示，PUVA-SP-DC刺激受者T细胞增殖反应的能力较低，PUVA-SP-DC还可诱导受者T细胞Foxp3表达上调，培养上清中的IFN-γ水平较低；6、各组同种异体大鼠移植心脏的平均存活时间(MST)分别是：Control组6.7天，DC组7.8天，PUVA-SP组5.3天，SP-DC 5.5天，PUVA-SP-DC12.4天。PUVA-SP-DC组的MST明显长于其余各组。8、与其余各组相比，PUVA-SP-DC组大鼠血清Th1型细胞因子(IL-2和IFN-γ)的表达最低，而Th2型细胞因子(IL-10和IL-4)的表达显著升高；9、PUVA-SP-DC组大鼠外周血Foxp3表达明显高于其余各组。结论：1、应用显微缝合技术可建立稳定的大鼠异位心脏移植模型；2、应用改良的二袖套法血管吻合法可建立稳定的大鼠原位肝脏移植模型；3、大鼠骨髓细胞在GM-CSF和IL-4刺激下，可培养扩增出能满足实验需求的imDC；4、采用PUVA的处理方法可有效诱导脾细胞凋亡；5、imDC可有效吞噬PUVA处理的凋亡脾细胞(PUVA-SP)，PUVA-SP并不刺激DC的表型成熟；6、负载PUVA-SP的DC诱导受者T细胞的免疫低反应性及Foxp3表达上调；7、输注负载PUVA-SP的受者imDC，可延长大鼠移植心脏的存活时间；8、PUVA-SP-DC的共刺激分子表达较低，受者Th1／Th2平衡向Th2方向偏移，移植受者Foxp3+调节性T细胞(Treg)比例增高，可能是移植免疫反应下调的主要机制。