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目的:探讨外源性P21基因转染对体外培养的人视网膜色素上皮(humanretinalpigmentepithelial，hRPE)细胞增殖的抑制作用及作用机制，为治疗增生性玻璃体视网膜病变(PVR)提供新的基因治疗思路。
方法:(1)以含有P21全长序列的质粒pCEP-P21为模板PCR扩增P21cDNA，应用基因重组技术与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建以GFP为报告基因的重组表达质粒pEGFP-P21，酶切及序列测定检测插入片段的正确性。(2)hRPE细胞原代和传达培养，传至第三代时，通过细胞爬片，应用抗人细胞角蛋白染色的免疫组织化学方法鉴定培养的细胞。(3)通过脂质体介导将含GFP的重组表达质粒pEGFP-P21转入体外培养的hPRE细胞。以转染相同剂量空载体pEGFP-C1的孔为转染对照组，以未作转染的hRPE细胞为非转染空白对照组。(4)在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP-P21融合蛋白在细胞中的分布和定位，并检测其在转染后6、12、24、48、72h的转染效率；用Westernblot方法分析P21蛋白的表达。(5)转染72h后应用RT-PCR检测各组RbmRNA的表达；Westernblot方法分析Rb蛋白的表达水平，并分析Rb蛋白的磷酸化情况。(6)免疫组化检测转染后72h各组PCNA(proliferatingcellnuclearantigen，增殖细胞核抗原)的表达情况；流式细胞技术分析细胞周期；细胞生长曲线、MTT法来检测转染后hRPE细胞的增生活性。
结果:(1)酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时出现2条带，大小分别为500bp和5Kb，与理论预计相符；重组质粒中P21目的基因片段DNA序列及读码框架完全正确。酶切、DNA测序均证实插入片断的正确性。(2)抗人细胞角蛋白染色的阳性率几乎达100％，成功地在体外原代及传代培养了hRPE细胞。(3)荧光显微镜观察结果显示在转染空载体pEGFP-C1对照组中，细胞内绿色荧光呈弥散分布；转染重组质粒pEGFP-P21组中，绿色荧光在细胞胞浆胞核内都有表达，胞核内表达明显，呈强荧光显示，与P21基因的表达一致；pEGFP-P21在转染后6、12、24、48、72h的转染率分别为3.65±0.88％、11.54±1.26％、26.27±1.39％、40.3±2.63％、32.9±1.86％。(4)Westemblot进一步证实了pEGFP-P21融合基因的表达：融合蛋白在50KD处出现阳性条带，转染对照组的GFP蛋白于29KD处出现阳性条带，而空白对照组未出现特异条带。(5)活细胞计数生长曲线及MTT实验结果可见，hRPE细胞在转染pEGFP-P21后其增殖活性降低(P＜0.01)，生长曲线平缓；而转染空载体组细胞和空白对照组细胞增殖活性差异无统计学意义(P＞0.05)。P21高表达明显抑制hRPE细胞生长，于转染后1、2、3、4、5、6d生长抑制率分别为14.3％、27.3％、33.3％、43.5％、45.1％和42.3％，且第5天抑制率最高。(6)细胞周期分析显示，P21基因转染细胞72小时后G1期和G0细胞由49.65％增至78.63％，S期细胞和G2/M期细胞分别由33.64％减少至11.01％，16.53％减少至10.29％，表现为明显的G0/G1期阻滞，差异有显著性(P＜0.01)，但未见明显的促调亡作用；转染空载体pEGFP-C1组与空白对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。(7)质粒转染72小时后，Westernblot检测到各组都出现2条蛋白带，1条代表高磷酸化Rb蛋白(115KD)，另1条分子量较小的条带为去磷酸化Rb蛋白(105KD)。空白对照组和转染空质粒对照组细胞的Rb蛋白主要以磷酸化形式存在，呈高度磷酸化状态(去磷酸化为20％)，二者无显著差异(P＞0.05)，而转染pEGFP-P21组的hRPE细胞所表达的Rb蛋白主要是去磷酸化Rb蛋白。同两组对照组相比较，转染pEGFP-P21组的去磷酸化比例增加为60％，磷酸化的Rb减少。(8)RT-PCR显示转染pEGFP-P21组RbmRNA表达量低于两组对照组(P＜0.05)。
结论:成功构建了pEGFP-P21质粒。hRPE细胞能高效表达pEGFP-P21融合基因，细胞核内表达明显，实现了P21和GFP的共表达，可以利用GFP来指示P21基因的表达及功能定位。P21基因的过度表达可抑制视网膜色素上皮细胞增殖，这一过程不是通过细胞毒性作用来实现的而与增加Rb蛋白去磷酸化水平，调控G1/S期检测点功能有关。