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目的:建立人脐带间质干细胞来源的exosomes(hucMSC-Ex)预防顺铂诱导的HK-2细胞损伤模型,评价其对顺铂诱导的HK-2细胞损伤的预防保护作用。通过对自噬相关分子的分析检测,探讨细胞自噬作用在其中发挥的重要作用,并初步阐明hucMSC-Ex预防顺铂诱导的HK-2细胞损伤的相关分子作用机制。 方法:收集无血清培养的人脐带间质干细胞(hucMSCs)和人成纤维细胞(HFL1)的培养上清,以ExoQuick-TCTM试剂盒分离纯化两种细胞来源的exosomes。透射电子显微镜和Nanosight纳米颗粒示踪技术观察exosomes的形态大小,免疫胶体金技术、流式细胞术和Western Blot技术检测其生物学标记。构建hucMSC-Ex预防顺铂诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)损伤模型,分组设置为:正常对照(Normal)组、Cisp+PBS组、Cisp+hucMSC-Ex组和Cisp+HFL1-Ex组。预先加入hucMSC-Ex处理,然后经顺铂诱导处理16h后收集细胞标本;Western Blot,TUN EL,免疫荧光、流式细胞术以及MTT等技术分别检测HK-2细胞的增殖、凋亡和自噬等相关指标。提取细胞RNA,然后逆转录为cDNA并利用qRT-PCR技术检测HK-2细胞自噬相关基因的表达情况。提取exosomes中的miRNAs,并利用qRT-PCR技术检测hucMSC-Ex和HFL1-Ex中的miRNAs;同时提取hucMSC-Ex预处理的于不同时间点经顺铂诱导HK-2细胞的miRNAs,检测其中miR-155的表达。 结果:透射电子显微镜和Nanosight分析发现分离纯化的hucMSC-Ex呈圆形,免疫电镜、流式细胞术和Western Blot检测CD9、CD81、CD63以及CD44等exosomes相关标记蛋白。HK-2细胞经顺铂处理后,细胞形态由圆形或椭圆形变为纤维状或梭形;同时凋亡蛋白Bax的表达在一定范围内随着顺铂浓度以及作用时间的增加而增加。hucMSC-Ex预处理HK-2细胞后,结果显示hucMSC-Ex能促进顺铂诱导的HK-2细胞增殖蛋白PCNA的表达,细胞增殖能力有所增强;促进抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2以及细胞周期蛋白Cyclin D1的表达;抑制HK-2细胞凋亡蛋白Bax的表达和TUNEL阳性细胞数目增多;同时也促进了PI3K/AKT通路相关蛋白PI3K和AKT蛋白的表达;相应地,hucMSC-Ex顸处理HK-2细胞后,细胞自噬相关基因ATG5和ATG7的表达上调,自噬相关蛋白LC-3B和Beclin1的表达增强;然而自噬内源性抑制分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)的活化却受到相应的抑制,而HFL1-Ex预处理后则无明显的上述作用。QRT-PCR检测发现hucMSC-Ex和HFL1-Ex表达miR-99a-5p和miR-155。顺铂诱导HK-2细胞后,miR-155在四个时间组中的表达明显增强,而hucMSC-Ex预处理后,miR-155在4h时表达明显上调。 结论: HucMSC-Ex可预防顺铂诱导的HK-2细胞损伤;同时也能够促进顺铂诱导的HK-2细胞的自噬作用;其预防作用可能是hucMSC-Ex通过分泌miR-155调控细胞自噬实现的。 本研究为hucMSC-Ex在预防肾损伤方面的临床应用领域提供了可靠的实验数据。