溶栓药物的发展已历经三代，第一代溶栓药物如SK等是非纤维蛋白特异性的，有较好的溶栓作用，但引起出血等不良反应多且会引起严重的免疫反应；第二代如t-PA，可选择性地活化结合在纤维蛋白表面的纤溶酶原，引起出血等不良反应相对较轻，然而它在体内的半衰期很短，持续静脉滴注增加了不良反应的发生。rPA是第三代溶栓药物，是t-PA的缺失突变体，在保留了t-PA的溶栓特异性的基础上，缺失了影响t-PA寿命的结构，因此体内半衰期较长，为t-PA的3～5倍，临床上可静脉注射给药，是较理想的溶栓药物之一。但给药剂量较大，价格较贵。因此，如何降低生产成本是rPA在临床中可广泛使用的一个关键因素。 rPA制造成本较高的原因，主要由于表达量和复性率不高。本研究的主要目标是提高表达量及复性率。 抽提Bowes黑色素瘤细胞总RNA，逆转录得到cDNA，分别在t-PAmRNA的5‘和3’端设计引物，以PCR扩增得到t-PA的cDNA。以引物ATGGTACCGATGACGACGACAAGTCTTACCAAGGAAACAGYGACTGCGTTGTCACG和ATAAGCTTTCACGGTCGCATGTTGTCACGPCR扩增得rPA的cDNA，与表达载体pET32a(+)的连接，转化BL21(DE3)，得表达菌BL21(DE3)/pET32a(+)/rPA。表达菌以IPTG诱导表达融合蛋白Trx-rPA，经胶密度扫描分析占总蛋白的量大于20﹪，主要形成包涵体。表达产物以t-PA的C-端单抗作Westernblot鉴定，表明表达产物融合蛋白中含rPA。IPTG诱导剂用量0.5～1mmol/L为宜，诱导表达3～4h表达量最高。反复接种平板培养100代后，表达质粒和表达量均未见变化。表达菌高密度发酵，表达量为22﹪。包涵体经洗涤纯度可达50﹪，以IDA-Sepharose层析纯化，纯度可达80﹪。20mmol/L胱氨酸衍生，调pH3.0，对dH20于4℃透析。按每次增加0.05mg/ml的量，加至复性缓冲液中，间隔30min，复性溶液的最终蛋白浓度为0.5mg/ml。分子量截留值3万膜超滤浓缩，以sETI-Sepharose层析纯化，融合蛋白Trx-rPA的纯度达90﹪以上，比活可达30万IU/mgPr。 ETI是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，不仅可以抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，也可以抑制t-PA。以固定化ETI为基础的亲和层析是纯化丝氨酸蛋白酶、特别是纯化t-PA、β-胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶和凝血酶等蛋白酶的一种重要方法。本研究将ETI基因第一个Aa突变为Ser，前10个氨基酸选用E.coli偏爱密码子，人工合成DNA得sETI的基因，克隆至表达载体pRSETC，转化BL21(DE3)，获得sETI表达菌BL21(DE3)/pRSETC/sETI。表达菌经培养、IPTG诱导表达，sETI主要以包涵体形式存在。高密度发酵，表达量达30﹪。包涵体经洗涤后，以含7mol/L盐酸胍和20mmol/LDTT的溶解液溶解，调pH2.5，对4mol/L尿素(pH2.5)于4℃透析。按每次增加0.1mg/ml的量，以脉冲方式加至复性缓冲液中，间隔30min，复性溶液的最终蛋白浓度为1.0mg/ml。后续以Q-Sepharose和SP-Sepharose层析组合纯化，可得SDS-PAGE纯度大于98﹪、比活性为1.55IU/mgPr.的sETI。本研究发酵结束菌密度OD600达到87.3，1L发酵液可制得sETI纯品1350mg。sETI-Sepharose亲和胶可吸附rPA的融合蛋白Trx-rPA，1ml胶最佳吸附融合蛋白Trx-rPA的量达2mg。4000mgsETI即可制备5000mlsETI-Sepharose亲和胶，1次层析可纯化10000mg融合蛋白Trx-rPA。 EK识别的序列为(Asp)4-Lys，具有较高的专一性，酶切反应的条件比较温和，一定的蛋白变性剂浓度如4mol/L尿素等对酶活性影响不大，在较广的范围内如pH4.5～9.5、4～45℃等条件下亦能有效地酶切融合蛋白。在基因工程制药领域EK为融合蛋白表达时下游纯化的首选工具酶之一。取新鲜牛十二指肠粘膜上皮组织，抽提总RNA，逆转录获得cDNA。以引物CAGCGGTACCGATGACGACGACAAGATTGTCGGAGGAAGTGACTCCAG和CAGCGGATCCCTAATGTAGAAAACTTTGTATCCA进行PCR扩增得牛肠激酶轻链cDNA，克隆于表达载体pET39b(+)，转入BL21(DE3)，获得融合蛋白DsbA-EKL表达菌BL21(DE3)/pET39b/rEKL。高密度发酵，IPTG诱导，表达量23﹪。产物主要以包涵体存在。经洗涤，以含6mol/LGdm-HCl和100mmol/LDTT的溶解液溶解，调pH3.0，对4℃冷水充分透析。以5mmol/L胱氨酸衍生。按每次增加0.03mg/ml的量，加至复性缓冲液中，间隔30min，复性溶液的最终蛋白质浓度为0.3mg/ml。复性溶液以分子量截留值30kD的膜超滤浓缩，并对缓冲液(pH7.4)充分透析，加入CaCl2至2mmol/L，10℃放置15min。以IDA-Sepharose和Q-Sepharose层析纯化，1L发酵液可得纯度95﹪以上的rEKL60mg以上。rEKL在酶解Trx-rPA时有较高的活性，1mgrEKL可裂解500mgTrx-rPA，可完全满足以融合蛋白Trx-rPA制备药用rPA的需要。 融合蛋白Trx-rPA中，rPA置于EK的酶切识别位点(Asp)4-Lys之后，rEKL酶切融合蛋白后，可得完整的scrPA。由于酶切反应体系中存在具有蛋白酶活性的Trx-rPA及酶切后释放的scrPA，或者rEKL也具有一定非专一活性，因此在酶切反应过程中有一定量的dcrPA产生，在融合蛋白Trx-rPA酶切反应及纯化过程中，减少scrPA降解为dcrPA是一个不可忽视的问题。比较Arg、Lys和氨基己酸对rEKL酶切融合蛋白的影响。结果表明，0.1mol/L氨基己酸(pH5.0)中rEKL酶切融合蛋白Trx-rPA效果较好，dcrPA的比例较少。融合蛋白Trx-rPA酶切反应后，体系中主要为scrPA及融合头Trx，残留的少量融合蛋白Trx-rPA、微量的rEKL及可能降解的dcrPA。最佳的纯化方案为先进行sETI-Sepharose层析分离得到scrPA和Trx-rPA，再以IDA-Sepharose层析纯化得到scrPA。SP-Sepharose层析，主要是为了更换缓冲液体系，使制备的scrPA满足于临床应用。本研究1L发酵液可制备rPA200mg以上，具有较高的生物活性，其比活性为580000IU/mgPr.；纯度以SDS-PAGE及RP-HPLC测定，均为98﹪以上，；分子量以SDS-PAGE测定为39.8kD(±10﹪)，以质谱测定为39594Da；等电点为pI7.46，与对照品Rapilysin一致。N末端氨基酸序列为SYQGNSDCYFGNGSA，与理论值一致；氨基酸组成分析结果与理论值一致；肽图分析，连续三批制备rPA的肽图一致。满足临床药用的要求。