灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)是一种能感染番茄、葡萄、草莓等200种以上的植物并引起灰霉病,对农作物生产造成严重危害的植物病原真菌。为了有效防治灰霉病,本研究组开展了通过农杆菌介导的转化技术构建灰葡萄孢T-DNA插入突变体库的研究。本实验利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的T-DNA插入技术对灰葡萄孢菌进行了遗传转化,并对转化子进行了潮霉素选择标记的抗性稳定性检测以及单胞分离纯化,得到了 107个转化子。然后通过不同浓度的CFW平板从上述转化子中筛选出了 27株可能与细胞壁组分合成相关的转化子。实验利用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术扩增了上述27株转化子的T-DNA插入位点旁侧序列,并通过对旁侧序列进行BLAST分析,获得了 5个T-DNA插入到基因内部的突变体(Q-74,Q-20,Q-25,Q-33,Q-103)。其中的Q-74突变株为单竣酸转运蛋白(monocarboxylate transporter,MCT)基因的T-DNA插入突变株。本实验选取Q-74作为研究对象,对灰葡萄孢中的单羧酸转运蛋白基因(BcMCT1)进行分析。RNA表达实验和Southern blot分析证明,Q-74中的BcMCT1基因受到T-DNA单拷贝插入而失活。为了更好的研究BcMCT1基因功能,我们构建了 Q-74的基因互补菌株(BcMCT1-C)。通过对野生型灰葡萄孢B05.10、突变株Q-74和基因互补菌株BcMCT1-C的生物学特性分析发现,BcMCT1具有转运乙酸和丙酮酸等单羧酸的功能,对菌体生长、细胞壁完整性和侵染番茄叶片的能力也有明显影响。通过BLAST搜索,我们发现灰葡萄孢有6个MCT同源蛋白基因,但迄今为止这些基因的功能仍然未知。本实验成果可以为进一步研究上述6个MCTs基因的单羧酸转运功能,揭示MCTs在灰葡萄孢的菌丝生长、产孢能力以及致病性等方面的作用机理提供理论和实验依据。