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橄榄[Canarium album(Lour.)Raeusch]是一种药食同源的保健水果,具有多种功效。然而口味苦涩成了其品质的一个重要限制因素。前人研究推测金丝桃苷可能是其苦涩味的主要原因。因此本研究以普通橄榄(‘长营’和‘檀香’)和清淡型橄榄(‘清榄一号’和‘梅埔二号’)为试验材料,研究其果实在不同的发育时期金丝桃苷含量变化及其代谢相关基因表达的规律,为培育涩味清淡的高品质橄榄奠定基础。主要的研究结果如下: 1.以‘长营’、‘檀香’、‘清榄一号’和‘梅埔二号’四个橄榄品种(系)果肉作为试验材料,利用高效液相色谱仪对它们果实不同发育时期的金丝桃苷含量进行测定。结果表明:(1)金丝桃苷的含量在普通橄榄和清淡型橄榄组内各具有相似的变化趋势,(2)‘长营’和‘檀香’品种中金丝桃苷的含量均显著高于‘清榄一号’和‘梅埔二号’;(3)四个橄榄品种(系)中金丝桃苷的含量在果实成熟的前期和后期(花后50-70 d以及150-190 d),变化趋势是一致的。 2.以‘清榄一号’橄榄果肉作为试验材料,利用同源克隆获得4种常用荧光内参基因:ACTB7、GAPDH3、TUB5、G6PDH2的保守序列,并检测它们分别在4个橄榄品种(系),8个果实发育时期中的表达水平。最后通过geNorm、Bestkeeper、NormFinder3种计算程序对4种内参进行表达稳定性的比较与分析。结果表明:在品种和时期的综合比较中,ACTB7为表达稳定性最高的单基因,而组合方面则以ACTB7/TUB5最优。 3.采用同源克隆的方法获取了金丝桃苷代谢途径中F3’H、F3H和FLS基因的cDNA全长序列,分别为1644 bp,1280 bp和1191 bp,分别包含1554 bp、1095 bp和1011 bp的开放阅读框。其中:F3’H共编码517个氨基酸,编码的氨基酸序列含有P450结构域和半胱氨酸亚铁血红素结合域保守区;F3H共编码364个氨基酸,在编码的氨基酸序列中含有2OG-FeII-Oxy保守结构域,属于PcbC家族; FLS共编码336个氨基酸,在编码的氨基酸序列中含有2OG-FeII-Oxy保守结构域,属于 PcbC家族。分别将三个基因的 cDNA与获取的对应gDNA序列进行比对,发现F3’H、F3H和FLS的基因组DNA中均含有两个内含子。 4.以‘长营’、‘檀香’、‘清榄一号’和‘梅埔二号’4个橄榄品种(系)8个果实发育时期的果肉作为试验材料,利用实时荧光定量PCR技术测定F3’H、F3H和FLS3个金丝桃苷合成相关基因在橄榄不同发育时期的表达量。结果表明:(1)在同一品种(系)内,F3’H和F3H两个基因的表达量变化趋势基本一致,而FLS的变化规律与二者不一;(2)在‘清榄一号’、‘梅埔二号’和‘檀香’三个橄榄品种(系)间,F3’H和F3H两个基因的表达量随果实成熟均呈下降趋势,而在‘长营’品种中则呈减增交替的变化趋势;(3) FLS在两个普通橄榄品种中随果实成熟表达量呈现下降趋势,而在两个清淡型橄榄品种(系)中则整体呈现后期回升的趋势。 5.通过对金丝桃苷的含量与三个生物合成相关基因表达水平的相关性比较,判断相较于F3’H和F3H,FLS对金丝桃苷合成的影响更大。