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背景和目的随着人口老龄化的发展和脑血管病患病率的升高,血管性痴呆(VascularDementia,VD)的发病也不断上升。张振馨等人的研究显示,我国年龄≥65岁者,调整抽样误差后血管性痴呆总患病粗率为1.1%。因此,探索血管性痴呆发生的危险因素,早期诊断方法和防治措施,已经成为当前我国临床医学和基础医学研究的重要课题。研究发现,兴奋性氨基酸毒性和细胞凋亡参与了血管性痴呆的病理过程。在脑内兴奋性氨基酸主要是谷氨酸和甘氨酸,谷氨酸含量最多,分布最广。谷氨酸受体分为离子型和代谢型两大类,离子型受体又分为NMDA受体,AMPA受体,KA受体。缺血缺氧将导致NMDA受体的过度激活,引起细胞内钙离子超载,激活一氧化氮合酶,产生过量一氧化氮,产生细胞毒性;胞内钙离子超载,使线粒体去极化,细胞色素C释放,激活Caspase家族,引起细胞凋亡。盐酸美金刚为中等亲和力,非竞争性,电压依赖性NMDA受体阻断剂,能够阻断NMDA受体过度开放导致的细胞内钙离子超载,减少钙离子超载继发引起的细胞凋亡,明显减轻兴奋性氨基酸毒性,对神经细胞具有保护作用。本实验用双侧颈总动脉永久结扎法建立血管性痴呆的大鼠模型,用Y型迷宫评价大鼠的学习记忆能力,HE染色观察大鼠海马神经元的形态学改变,免疫组化法检测大鼠海马神经元中的nNOS和Caspase-3的表达,TUNEL法检测各组大鼠海马神经元的凋亡情况,探讨盐酸美金刚对血管性痴呆大鼠海马神经元的保护作用机制。材料与方法1动物及分组健康雄性Wistar大鼠36只(河南省医学动物实验中心提供),16月≤月龄≤18月,质量(400±50)g,随机分为假手术组、血管性痴呆组和盐酸美金刚治疗组,每组12只。2模型制备及药物干预采用双侧颈总动脉(CCA)永久结扎法制备模型,盐酸美金刚组给予盐酸美金刚3mg/kg(溶解于生理盐水中)灌胃,每同1次,共6w;假手术组和血管性痴呆组给予生理盐水1ml灌胃,每日1次,共6w。3学习记忆能力测定灌胃结束后用Y-型迷宫测试学习能力,以连续10次测试中有9次正确反应即为达到学会标准,记录动物达到标准所需电击的次数,以此作为学习能力的指标。24 h后,重复以上实验过程,观察大鼠的记忆能力。4标本制备行为学测试完毕后,将大鼠麻醉,经心脏灌注内固定取脑,在鼠脑最宽部位(海马冠状位)取3mm,多聚甲醛固定,梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋,连续冠状切片,片厚约5μm,HE染色观察形态学变化,采用SP免疫组化法检测nNOS和Caspase-3,采用TUNEL法测定凋亡细胞。5免疫组化及TUNEL染色的结果判定免疫阳性细胞被染成棕黄色,nNOS和Caspase-3都是胞浆着色,采用Qwin550CW图像处理与分析系统,测定阳性反应物质的平均积分光密度值。TUNEL染色时凋亡细胞为胞核着色,呈棕黄色,统计凋亡细胞的数量,以百分比为统计学指标。6统计学方法使用SSPS13.0统计软件进行数据处理,数据以均值±标准差((?)±s)表示,采用单因素方差分析法,用S-N-K法进行组间的两两比较。以α=0.05作为检验水准。结果1学习记忆成绩血管性痴呆组大鼠达标时所需电击次数最多(学习成绩79.25±2.01次,记忆成绩69.17±1.70次),盐酸美金刚组居中(学习成绩63.16±1.75次,记忆成绩53.17±1.85次),而假手术组最少(学习成绩50.83±1.80次,记忆成绩40.67±1.83次),三组间的成绩有显著性差异,P＜0.01。2海马CA1区神经元形态学比较HE染色后在400倍光镜下观察到:假手术组神经元数量很多,排列紧密、均匀整齐,胞核呈圆形或椭圆形,核仁明显,染色质均匀;血管性痴呆组神经元数目较少,排列紊乱,胞核深染,固缩,核仁消失,胞浆周围发现空晕,胞间距较大;盐酸美金刚组正常神经元数量较多,排列较密,胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰,染色质丰富,可见少量固缩变性的神经元。3免疫组化结果光镜下观察nNOS,Caspase-3阳性细胞呈胞浆棕褐色细颗粒状着色。假手术组有极少量弱染及中等强度染色的nNOS阳性神经元;血管性痴呆组nNOS阳性神经元数量大量增加,染色较深;盐酸美金刚组见少量弱染及中等强度染色的nNOS阳性神经元,数量较血管性痴呆组明显减少;nNOS的平均积分光密度值依次为:105.63±3.52,175.87±3.34,140.23±2.30,F=1539.67,p＜0.01;Caspase-3的染色结果与nNOS相似,Caspase-3平均积分光密度值依次为:99.54±5.06,162.78±5.25,132.78±5.36,F=439.37,p＜0.01,三组间的阳性区平均积分光密度值有显著性差异。4细胞凋亡假手术组只有零星的凋亡细胞,血管性痴呆组见大量凋亡细胞,盐酸美金刚组凋亡细胞较血管性痴呆组明显减少,三组间的凋亡细胞计数百分比有显著性差异(依次为6.33±3.65,56.17±3.56,33.75±2.70,F=672.91,p＜0.01)。结论1细胞凋亡参与了血管性痴呆的病理生理过程,而Caspase-3和nNOS可能是引起细胞凋亡的重要蛋白酶。2盐酸美金刚能够减轻血管性痴呆大鼠海马神经元的损伤,提高其学习记忆能力,其机制可能是通过抑制血管性痴呆大鼠nNOS和Caspase-3的过度表达,有效减少细胞凋亡而实现的。