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癌症严重威胁人类健康,癌症的高效治疗已经成为医学领域的研究热点。传统抗癌活性肽(ACPs)因具有高活性、高选择性、易于穿膜吸收等特点,在癌症治疗中有着广泛的应用前景。但ACPs存在血浆半衰期较短、易被蛋白酶降解等缺陷,很大程度限制了它们在临床中应用。因此,对ACPs进行结构修饰拟解决ACPs的不足具有重要的研究意义。本研究以从穴居狼蛛毒液提取出的线性两亲型抗癌活性肽Lycosin-Ⅰ为对象,采用氨基酸替换策略将Lycosin-Ⅰ序列中的赖氨酸替换成精氨酸,获得Lycosin-Ⅰ类似物,命名为R-lycosin-Ⅰ。采用DLS、CD及TEM对R-lycosin-Ⅰ的理化结构进行了表征,并研究其抗癌活性、血清稳定性及作用机制。DLS结果表明:修饰后的R-lycosin-Ⅰ Zeta电势增加,粒径减小。TEM显示Lycosin-Ⅰ及R-lycosin-Ⅰ形貌均呈球形。CD谱图结果表明Lycosin-Ⅰ及R-lycosin-Ⅰ均在PBS溶液中呈现出无规则卷曲,在TFE溶液中呈现出α-螺旋结构。CCK-8活性和流式细胞凋亡实验表明,R-lycosin-Ⅰ对肿瘤细胞的活性增强(约2倍)且选择性不变。细胞摄取与释放研究结果表明:相对Lycosin-Ⅰ,R-lycosin-Ⅰ更容易被A549细胞所摄取且摄取的速度更快。摄取进入细胞后,R-lycosin-Ⅰ更加容易被释放出来,在细胞内呈现出弥散状态,而Lycosin-Ⅰ则呈现出点状分布。血清稳定性研究结果表明R-lycosin-Ⅰ在8 h时对A549细胞的抑制率为80%,而Lycosin-Ⅰ在30 min时活性己经丧失约50%。通过模拟体内环境的3D肿瘤实验证实R-lycosin-Ⅰ对肿瘤球具有更强的抑制作用。通过激光共聚焦z-扫描来研究R-lycosin-Ⅰ在实体肿瘤球中的穿透能力,结果表明R-lycosin-Ⅰ具有更强的肿瘤穿透性,穿透肿瘤球体约30 lpm,而Lycosin-Ⅰ只有10 μm。Western Blot研究表明R-lycosin-Ⅰ是通过上调P27的表达来抑制细胞增殖和促进细胞色素C的释放来诱导细胞的凋亡。为了进一步提高R-lycosin-Ⅰ的活性、选择性及稳定性,拟采用糖基化修饰的策略,对R-lycosin-Ⅰ进行进一步修饰。以葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、氨基葡萄糖等五种单糖的衍生物为修饰单元,戊二酸酐为连接臂,对R-lycosin-Ⅰ进行糖基化修饰,制得五种糖肽。采用DLS、TEM和CD对五种糖肽的理化结构进行表征,并研究其生物活性。DLS表明五种糖肽的Zeta电势在5.0±0.35 mV～58.9±0.35 mV之间,平均粒径在189.0±0.47～749.3±1.3之间。TEM显示五种糖肽形貌均呈球形。CD谱图结果表明五种糖肽均在PBS溶液中呈现出无规则卷曲,在TFE中呈现出α-螺旋结构。CCK-8活性实验结果表明,不同糖肽具有不同的活性。相对于R-lycosin-Ⅰ对A549细胞的活性,Glu-R-Iycosin-I的活性提高近1.8倍;Gal-R-lycosion-I活性增强2.5 倍;Man-R-lycosin-Ⅰ 的活性丧失(＞100 μM);Ara-R-lycosin-Ⅰ 与GluNAc-R-Iycosin-I的活性几乎不变。血清稳定性实验结果表明Gal-R-lycosion-I 与 Glu-R-lycosin-Ⅰ 在 48h 时抑制率仍为 80%,血清稳定性大大增强。综上,相对于Lycosin-Ⅰ,经氨基酸定点突变得到的R-lycosin-Ⅰ对血清的稳定性、抗实体瘤作用等生物活性明显增强。通过对R-lycosin-Ⅰ的糖基化修饰,发现不同的糖基单元对糖肽的活性影响不同,这一发现为后面糖肽作用机制的解析提供基础,使Lycosin-Ⅰ的拓展具有更进一步研究的价值。