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目的:研究低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)是否参与缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元Necroptosis, necrostatin-1(Nec-1)对其表达是否有影响。
方法:原代皮质神经元培养14天,予Casepase抑制剂z-VAD-FMK20μmol/L预保护,缺糖缺氧(OGD)2h、再灌注0、2、6、12、24、48h,进行LDH测定RT-PCR测HIF-1αRNA表达;免疫组化定性检测HIF-1α表达情况;Western blot检测总HIF-1α蛋白表达情况;分别提取细胞质、细胞核蛋白,Western blot分别检测胞质、胞核内HIF-1α蛋白表达情况。予不同浓度Nec-1(0.1、1、5、10、25、50μmol/L),原代皮质神经元OGD后检测LDH, RT-PCR和Western blot测HIF-1αRNA和蛋亡1表达。予YC-1(4μ mol/L)预作用30min, OGD2h再灌注12h检测HIF-1α蛋白表达水平及LDH水平。
结果:Casepase抑制剂z-VAD-FMK(20μmol/L)预作用30min,缺糖缺氧2h后培养基中LDH增加(P<0.05),再灌注12h达高峰;缺糖缺氧后HIF-1αRNA表达无变化(P>0.05);免疫组化检测显示细胞核和细胞质内均有蛋白表达;HIF-1α总蛋白表达增加(P<0.05),再灌注12h达高峰;神经元OGD2h、再灌注6h时细胞质HIF-1α蛋白表达达高峰(P<0.05),随后降低;再灌注12h时,细胞核HIF-1α蛋白表达达高峰(P<0.05),随后降低。Nec-15μmol/L时LDH明显降低(P<0.05),25umol/L时与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。予Nec-125μmol/L时HIF-1α蛋白明显减少(P<0.05),RNA无明显变化。予YC-1(4μ mol/L)作用后HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.05), LDH水平明显降低(P<0.05)。
结论:HIF-1α参与了缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元Necroptosis, Nec-1能够使HIF-1α蛋白表达降低,起到细胞保护作用。