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肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种快速进展、可累及上、下运动神经元的严重致死性神经系统变性病。研究发现,10%ALS为家族性的ALS(familial ALS,fALS),其中约20%fALS发病与超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase1,SOD1)基因突变有关。在SOD1基因上存在两种同一氨基酸位点上的不同突变SOD1 G41S和G41D,而携带这两种突变的患者临床表现明显不同,SOD1G41S突变型fALS患者病程进展迅速,平均生存期约为11.6个月;而SOD1 G41D突变型患者病程进展较为缓慢,平均生存期约为17年。自1993年Rosen等人发现SOD1基因突变和ALS发病有关后,研究者对此种ALS致病机制进行了一系列研究,但至今尚不清楚。目前认为,氧化应激、错误折叠蛋白聚集、线粒体功能障碍、谷氨酸盐兴奋毒性、轴索运输损害、非神经元细胞作用等都参与ALS的致病过程。另外,临床研究发现,ALS患者可出现轴突的高兴奋性,表现为持续性的钠电流增加,患者呈现出肌痉挛和肌束震颤;而先前也有研究发现在ALSG93A模型鼠原代脊髓运动神经元、ALS患者诱导多能干细胞来源的运动神经元及G93A模型鼠离体脑片中的运动神经元都出现过度兴奋的现象。电压门控性钠通道(voltage-gatedsodium channel,VGSC)是神经元的兴奋和动作电位产生、传导的重要元件,因此该通道电生理特性如果改变也将会影响神经元的兴奋性,从而导致疾病的发生。先前研究报道ALS SOD1 G93A模型鼠在疾病早期神经元VGSC电流出现异常。但是目前未有研究对SOD1 G41S和G41D突变的VGSC电生理特性进行探究。因此,为进一步探究SOD1 G41S和G41D突变在ALS中的致病机制,将本研究分为两个部分,首先构建过表达野生型(widetype,WT)SOD1、SOD1 G41S及 G41D 重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体;用上述rAAV感染小鼠神经瘤母细胞(N2a)以构建ALS细胞模型,并观察N2a细胞过量表达此两种突变蛋白后,对神经元VGSC电生理特性和凋亡分子表达的影响。第一部分SOD1WT、SOD1 G41S和SOD1 G41D rAAV载体的构建及鉴定目的构建过表达SOD1 WT、SOD1 G41S及SOD1 G41D重组腺相关病毒载体。方法首先,利用PCR扩增各目的基因片段,应用EcoRI和HindⅢ内切酶对pMT121(pAAV-hSyn-bGlobinintron-EGFP-pA)表达载体进行酶切后,回收纯化线性化表达载体。进而在无缝反应液作用下,将各目的片段与回收后的线性化表达载体进行同源重组后转化DH5α感受态细胞。利用菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆送测序,测序无误后进行质粒提抽。最后目的质粒与辅助质粒共转染HEK293细胞进行病毒包装,经纯化、浓缩、RT-PCR滴度测定后保存备用。结果PCR结果显示,在约765 bp、792 bp、521 bp、175 bp、367 bp可见特异性 RFP、GFP、SOD1WT、5’SOD1G41S/G41D、3’SOD1G41S/G41D 条带;应用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ内切酶对表达载体pMT121进行双酶切,回收4470 bp的线性化载体片段;菌落PCR转化子鉴定结果显示,SOD1WT重组质粒阳性克隆得到711bp片段、SOD1G415和SOD1G41D阳性克隆得到721bp片段;测序结果正确;72 h后获得3种SOD1 WT、SOD1 G41S和G41D rAAV颗粒,经浓缩、纯化、测定滴度分别为 2.43×1012 v.g./mL、2.28×1012 v.g./mL、2.52×1012 v.g./mL后,分装保存于-80℃备用。结论成功构建过表达SOD1 WT、SOD1 G41S及SOD1 G41D rAAV载体,病毒纯化、浓缩、滴度皆满足后续实验要求。第二部分SOD1WT、SOD1G41S和SOD1G41DrAAV载体在ALS细胞模型中的作用探究目的探究ALS SOD1上G41S和G41D两种突变型所致神经元VGSC电生理特性的差异及其可能的分子机制。方法构建过表达SOD1 WT、SOD1 G41S及G41D rAAV载体后,体外感染N2a细胞,将实验组分为3组:SOD1WT组、SOD1G41S和SOD1G41D组,并以无目的基因rAAV感染的N2a细胞为阴性对照(Control)组。利用全细胞膜片钳技术分别记录四组细胞VGSC电流,绘制通道快速激活和稳态失活曲线后分析相关参数。比较各组细胞凋亡分子Cleaved caspase-3在病毒感染后24、48和72 h不同时间点的表达情况。结果与Control组和SOD1 WT组比较,感染过表达SOD1 G41S、SOD1 G41D rAAV的细胞峰值电流显著增加(P<0.05),且SOD1G41S组显著高于SOD1 G41D组(P<0.01)。SOD1 G41S组和SOD1 G41D组细胞半数激活电压和半数失活电压显著高于Control组和SOD1 WT组(P<0.05);但SOD1 G41S组半数激活电压高于SOD1 G41D组(P<0.05);SOD1 G41S与SOD1 G41D组半数失活电压比较差异无显著性(P>0.05);各组激活、失活曲线斜率差异无显著性(P>0.05)。虽然 24 和 48h,SOD1WT、SOD1G41S、SOD1G41D 组 Cleaved caspase-3表达量差异无显著性,但转染72 h后,SOD1 G41S组和SOD1 G41D组 Cleaved caspase-3 表达量高于 SOD1 WT 组,且 SOD1 G41S 组高于 SOD1 G41D 组。结论SOD1 G41S和SOD1 G41D突变通过加快VGSC快速激活和抑制失活过程提高神经元活性,且SOD1 G41S突变VGSC活性显著高于SOD1 G41D;SOD1 G41S突变型ALS快速进展病程可能与该突变型促进凋亡有关。