酒石酸泰乐菌素是一种广泛应用于畜禽养殖业中的大环内酯类广谱抗菌药,具有抗菌活性高、不良反应小、口服后吸收迅速、分布广泛、生物利用度低的特点。然而,国内外未见其口服后生物利用度很低的机理报道。为此,本试验拟开展肉鸡口服酒石酸泰乐菌素的首过效应及机制研究,通过肝肠首过效应的定量研究、鸡肝细胞内的代谢消除和肠细胞内的吸收转运以及酒石酸泰乐菌素在持续用药过程对代谢、转运相关蛋白表达的影响,深入探讨酒石酸泰乐菌素首过效应的机制,最后针对其原因探讨提高其口服生物利用度的策略。具体内容如下:1.酒石酸泰乐菌素在肉鸡体内生物利用度测定本研究旨在测定酒石酸泰乐菌素的口服生物利用度。首先建立泰乐菌素高效液相(HPLC)分析方法,然后测定酒石酸泰乐菌素药动学特点。20只健康的AA肉鸡随机分为口服组和静脉给药组,每组10只,两组分别按10 mg/kg b.w灌服和静注酒石酸泰乐菌素溶液。所有肉鸡在给予酒石酸泰乐菌素后24 h内从翅下静脉采血,HPLC法测定泰乐菌素的血药浓度,3P97药动学软件分析药-时数据。结果显示:建立的HPLC方法符合定量检测要求,肉鸡单剂量口服酒石酸泰乐菌素的药动学过程符合一室开放动力学模型,静注后的药动学符合二室开放动力学模型。口服酒石酸泰乐菌素后的药时曲线下面积(AUC)为0.79±0.11μg/mL·h,达峰时间(Tpeak)为1.33±0.18 h;静注酒石酸泰乐菌素后的AUC为6.82±0.56μg/mL·h。口服给药后的生物利用度(F)为11.58%。结果表明,鸡口服酒石酸泰乐菌素后,吸收迅速,生物利用度很低。2.酒石酸泰乐菌素在肉鸡体内肝肠首过效应的定量评价旨在研究不同给药途径对肉鸡口服酒石酸泰乐菌素生物利用度的影响,定量评价肝肠首过效应。40只健康AA雄性肉鸡随机分为口服给药组、十二指肠给药组、门静脉给药组和静脉给药组,每组10只。所有肉鸡在麻醉后,以10 mg/kg剂量按以上给药方式给予酒石酸泰乐菌素溶液,所有肉鸡在给药后24 h内从翅下静脉采血,HPLC法测定酒石酸泰乐菌素的血药浓度,用3P97药动学软件分析数据。结果显示:肉鸡单剂量口服和十二指肠给药后,酒石酸泰乐菌素的药动学过程符合一室开放动力学模型,门静脉和静脉注射给药后,酒石酸泰乐菌素的药动学过程符合二室开放动力学模型。各组的曲线下面积(AUC)分别为0.78±0.03,0.86±0.05,4.77±1.13,6.57±0.43(μg/mL)·h,门静脉给药组的AUC显著高于十二指肠组,静脉给药组的AUC显著高于门静脉给药组。表明酒石酸泰乐菌素在肉鸡内存在严重的肠道和肝脏首过效应,肠道影响最大,达82%,其次为肝脏达27%。3.酒石酸泰乐菌素在肠道中吸收转运的研究建立Caco-2单层细胞体外转运模型和肠道灌流模型,研究酒石酸泰乐菌素在肠细胞的吸收转运特点。Caco-2单层细胞体外转运模型中,考察孵育时间、酒石酸泰乐菌素添加浓度、添加EGTA和抑制P-gp等对酒石酸泰乐菌素吸收转运的影响。肠道灌流模型中,通过添加EGTA和抑制P-gp,分别对十二指肠、空肠和回肠进行单向灌流,考察酒石酸泰乐菌素吸收的主要肠段、主要方式和P-gp对酒石酸泰乐菌素转运的影响。结果显示,酒石酸泰乐菌素在Caco-2细胞中的转运呈现细胞旁转运和跨细胞转运并存,EGTA的存在会使转运系数剧增,而且体外细胞转运试验的转运系数分别为2.75±0.17,7.88±0.64和4.53±0.53,6.13±1.55,表明存在外排,抑制P-gp后外排减弱,通过转运系数推测肠道的吸收效率在20%～70%。而在小肠灌流过程中,十二指肠吸收迅速,是主要吸收肠段,在肠道的吸收以跨细胞转运为主,EGTA的存在难以提高吸收效率,维拉帕米的存在可以显著降低P-gp介导的外排,通过各肠段的转运系数推测在十二指肠吸收良好,而在空肠和回肠的吸收一般。表明酒石酸泰乐菌素在肠道的主要吸收肠断是十二指肠,主要吸收方式是跨膜转运,且P-gp参与了酒石酸泰乐菌素在肠道的外排转运。4.酒石酸泰乐菌素在肝细胞中代谢消除的研究利用本实验室建立的肝原代细胞体外代谢模型,研究酒石酸泰乐菌素在肝脏细胞内的代谢消除。考察孵育时间、肝细胞接种密度、酒石酸泰乐菌素添加浓度和抑制CYP1A、3A等因素,对酒石酸泰乐菌素代谢消除的影响。结果显示,酒石酸泰乐菌素在肝细胞中存在着代谢消除,而且有时间依赖性和浓度依赖性,符合酶促动力学特征。体外代谢消除过程中,60 min内,有约20%的酒石酸泰乐菌素被代谢消除,抑制CYP3A后,代谢消除的酒石酸泰乐菌素下降到10%,抑制CYP1A后,酒石酸泰乐菌素的代谢消除无明显变化。结果表明,CYP3A参与了酒石酸泰乐菌素在肝脏细胞的代谢消除,其通过代谢消除导致的首过效应降低酒石酸泰乐菌素的口服生物利用度。5.酒石酸泰乐菌素对肝脏和肠细胞中CYP1A、3A和P-gp表达的影响利用建立的肝原代细胞模型和Caco-2模型,进行酒石酸泰乐菌素对CYP1A、CYP3A和P-gp表达影响的体外研究,同时在鸡体内进行体内研究。体外研究各细胞都分为4组,分别为高剂量组(50μg/mL)、中剂量组(30μg/mL)、低剂量组(10μg/mL)和空白对照组,连续作用96 h后取样,荧光定量PCR检测mRNA水平变化,western-blot检测蛋白水平变化。体内研究分为两组,酒石酸泰乐菌素组和空白对照组,每组6羽,试验组连续7天按10 mg/kg体重灌服酒石酸泰乐菌素溶液,对照组灌服等量生理盐水,肉鸡继续饲喂不含任何药物的饲料。7天后取每只鸡的肝、十二指肠、空肠和回肠,荧光定量PCR和western-blot检测。结果显示,肝原代细胞中,10μg/mL和30μg/mL的酒石酸泰乐菌素显著抑制CYP1A和CYP3A的表达,是通过抑制其mRNA的表达进而抑制其蛋白的表达,50μg/mL的酒石酸泰乐菌素对CYP1A和CYP3A的表达无明显影响;Caco-2细胞中,高、中和低浓度的酒石酸泰乐菌素都抑制P-gp的表达;在鸡体内,酒石酸泰乐菌素对CYP3A在鸡体内各组织的mRNA和蛋白的表达皆呈现显著性抑制,而对CYP1A在肝脏和十二指肠呈现抑制,在肝脏的mRNA水平表达呈显著抑制,在十二指肠的蛋白水平表达呈显著抑制,酒石酸泰乐菌素对肝内P-gp在mRNA水平的表达呈现显著抑制。表明酒石酸泰乐菌素在鸡体内连续用药后会对CYP1A、3A和P-gp的表达呈现一定的抑制作用,进而影响其自身药动学特征或引起药物相互作用。6.提高泰乐菌素口服生物利用度方法的探讨为了提高泰乐菌素在健康AA肉鸡体内的口服生物利用度。试验选用140羽健康AA肉鸡,体重1.5±0.1kg,随机平均分为7组。分别从成盐形式、结构优化和抑制首过效应三个方面考察对泰乐菌素口服生物利用度的影响。其中成盐形式包括磷酸泰乐菌素组和酒石酸泰乐菌素组。两组分别按10 mg/kg.bw(以泰乐菌素计)进行单剂量灌服和静注磷酸泰乐菌素溶液和酒石酸泰乐菌素溶液;结构优化包括酒石酸泰乐菌素组和酒石酸泰万菌素组,如上分别口服和静注给药。抑制首过效应分为酮康唑组、维拉帕米组和空白对照组。这3组肉鸡在诱导3d后分别口服和静注酒石酸泰乐菌素。采用HPLC法测定血浆中泰乐菌素和乙酰异戊酰泰乐菌素的药物浓度,用3p97药动学计算软件处理血药浓度-时间数据,得出药代动力学参数及生物利用度。结果显示:成盐形式方面,静注后药动参数相一致,口服碟酸泰乐菌素和酒石酸泰乐菌素后血浆中显著变化参数Cmax分别为0.09±0.01和0.22±0.09μg/mL,AUC分别为0.56±0.082和0.89±0.12μg/mL·h,F分别为8.47%和12.92%,说明口服酒石酸泰乐菌素比口服磷酸泰乐菌素吸收好,口服生物利用度得到提高;结构优化方面,显著变化参数如下,静注酒石酸泰万菌素和酒石酸泰乐菌素后,Vd分别为0.61±0.07和0.29±0.04 L/kg,T1/2ke分别为1.98±0.21和1.50±0.21 h,口服后,Tpeak分别为0.76±0.38和1.87±0.38h,AUC分别为1.15±0.12和0.82±0.16,T1/2ke分别为1.86±0.44和1.46±0.44h,F分别为12.6%和16.7%,说明酒石酸泰万菌素吸收快、分布广、代谢慢,口服生物利用度得到提高;抑制首过效应方面,空白组、维拉帕米组和酮康唑组的F分别为12.1%、14.4%和14.5%,说明酮康唑通过抑制肝脏的CYP3A来抑制消除提高生物利用度,维拉帕米通过抑制P-gp来抑制外排提高生物利用度。