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空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni,C.jejuni）是一种微需氧的革兰氏阴性食源性病原菌。人类感染空肠弯曲菌可导致腹泻、呕吐、腹痛、发烧等症状,部分病例会发展为格林-巴利综合征或米勒费舍尔综合征等严重的自身免疫疾病,为人类健康和世界经济带来了沉重负担。Ⅵ型分泌系统（type Ⅵ secretion system,T6SS）是一种潜在的毒力因子;其为倒置镶嵌在细菌细胞膜上的类噬菌体样结构,通过该装置可以直接将效应蛋白注入宿主细胞并发挥生物学效应。不同国家和不同宿主来源的空肠弯曲菌中T6SS的流行分布具有差异,而空肠弯曲菌中国分离株中T6SS流行分布特征仅有零星报道,缺少系统性研究。本文建立了空肠弯曲菌T6SS的多重PCR检测方法和Western Blot检测方法;开展了对中国东部地区分离自不同宿主的空肠弯曲菌分离株中T6SS的流行分布特征研究;对T6SS缺失株和已测序分离株的生物学表型进行了分析,初步了解T6SS在空肠弯曲菌中发挥的潜在作用,旨在为空肠弯曲菌毒力因子研究提供数据支撑,也为解析分离自不同宿主来源的空肠弯曲菌致病机制做出新的尝试。一、空肠弯曲菌Ⅵ型分泌系统检测方法的建立对从NCBI数据库获取的1038株空肠弯曲菌T6SS基因簇结构进行了分析,确定了两个可用于检测的靶标基因,应用软件设计引物,通过反应条件优化、灵敏度实验等建立了空肠弯曲菌T6SS多重PCR检测方法;使用原核表达技术,诱导表达并纯化重组Hcp蛋白,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备了 Hcp单克隆抗体,通过特异性检测等试验建立了空肠弯曲菌T6SS Western Blot检测方法,并将两种方法进行了比较。结果显示,多重PCR方法能特异性扩增出ATCC43431、ATCC33560等阳性菌株的hcp（483 bp）和vgrG（758 bp）基因片段,而81-176、NCTC 11168等阴性菌株无条带,将PCR扩增产物测序结果与目的基因序列进行比对,其同源性均大于99%,该方法最优退火温度为50℃,最低检测限为10-3ng的DNA。与传统方法相比该方法筛选出的菌株T6SS基因簇更为完整。以重组蛋白rHis-Hcp为免疫原,rGst-Hcp为检测原,共获得4株杂交瘤细胞,分别为IgA、IgG1、IgG1和IgG2a亚类,效价均达到2×107以上,Western Blot结果显示均能特异性识别rGst-Hcp蛋白和天然的空肠弯曲菌Hcp蛋白,以4D6抗体建立了 Western Blot检测方法,使用74株分离株对两种检测方法进行验证发现,两种方法均具有高特异性,符合度为100%;PCR方法更迅速便捷,为空肠弯曲菌毒力因子的快速检测提供了技术支持,而基于蛋白表达水平的Western Blot检测方法能检测该菌是否为T6SS阳性,同时可以鉴定其携带的T6SS是否发挥功能。二、空肠弯曲菌Ⅵ型分泌系统分布特征分析基于本实验室建立的弯曲菌菌种库,获取了 2007～2020年分离自不同地区、不同宿主来源的空肠弯曲菌分离株共1430株,利用本研究建立的空肠弯曲菌T6SS多重PCR检测方法,结合全基因组测序技术,对其T6SS基因簇携带情况和基因环境进行分析。结果显示25.80%（369/1430）的分离株为T6SS阳性;分离自人的空肠弯曲菌T6SS阳性率（43.66%）显著高于其他动物源的分离株（24.73%）（P＜0.001）;对于同种养殖动物在不同养殖场内获得的分离株,其阳性率存在显著性差异,表明阳性率与宿主无关,T6SS基因簇的分布具有多态性;患病家禽体内分离到的空肠弯曲菌阳性率显著高于健康家禽的;阳性分离株中（35.78%）与腹泻相关的血清型比例显著高于阴性分离株（16.68%）（P＜0.001）。在基于核心基因组构建的进化树中,T6SS阳性分离株在进化树中成簇分布;对其基因环境分析发现,88.89%的T6SS基因簇位于基因组CJIE3中,11.11%的T6SS基因簇位于质粒上;而弯曲菌中常见的8种毒力基因与T6SS无关;T6SS基因簇在基因组和质粒上均能发挥功能,且可以通过转移元件在空肠弯曲菌间传播。三、空肠弯曲菌Ⅵ型分泌系统功能初步分析使用pMD-20T自杀质粒同源重组的方法构建了 T6SS全基因簇的缺失株,对野生株及T6SS缺失株的生物学特性进行研究,首先检测了 Hcp蛋白在两株菌中表达分泌情况,进而观察了该基因簇对空肠弯曲菌生长和运动力的影响,并研究了其与空肠弯曲菌毒力之间的关联性,另外还对已测序的74株分离株的相关表型进行了检测,以进一步确定T6SS在空肠弯曲菌中发挥的功能。结果显示,T6SS缺失后,Hcp蛋白无法正常表达分泌;T6SS缺失株和野生株生长速度基本相同,无明显差异;2株细菌穿刺接种于MH半固体培养基后,野生株和T6SS缺失株可从接种处向四周扩散生长形成明显的环状结构,且运动圈直径无显著差异;T6SS失活后空肠弯曲菌对宿主的毒力均表现出一定程度的下降:在Caco-2细胞的粘附侵袭实验中,T6SS缺失株的粘附率只有野生株的49.05%,侵袭率为其79.87%,T6SS的缺失导致空肠弯曲菌对幼虫的杀伤力和毒力作用时间降低。对分离株的相关表型检测结果显示,T6SS阳性分离株与阴性分离株之间运动力无显著性差异,但阳性分离株的粘附侵袭能力和对大蜡螟幼虫的杀伤作用均显著高于阴性分离株,表明T6SS增强了空肠弯曲菌的毒力。