背景：诱导分化是指恶性肿瘤细胞在分化诱导剂的作用下,向正常或接近正常的细胞方向分化逆转的现象,它强调逆转肿瘤细胞恶性表型,使其趋于成熟分化,一般不引起肿瘤细胞的杀伤,从而克服了传统化疗在杀伤肿瘤细胞的同时对正常组织细胞的损伤所带来的毒副作用。肿瘤的分化疗法作为一种区别于传统肿瘤治疗理念的治疗手段已越来越多地得到了人们的关注。目前,常用的分化诱导剂包括维甲酸(retinoic acid, RA)类化合物、极性化合物、细胞因子、维生素D3及其类似物、某些抗肿瘤药物及中草药等,其中RA类化合物是分化诱导剂中最为重要、疗效最为确切并应用于临床的一类药物。随着全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)分化治疗急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)的成功,RA类药物也被越来越多地用于预防及治疗包括乳腺癌、皮肤癌、宫颈癌及中枢神经系统肿瘤在内的恶性肿瘤,而RA类药物的广泛应用也促使研究人员对其分化诱导机制进行了深入研究,以期寻找与细胞分化有关的潜在药物作用靶点,并基于开发全新的高效分化诱导剂及发现有效的药物联用方案而指导分化疗法在临床的合理应用。已有研究表明,RA通过与维甲酸受体结合而发挥诱导细胞分化的作用,维甲酸受体包括RARs (retinoic acid receptors)和RXRs (retinoid X receptors)二类,分别有α,p,γ三种亚型。维甲酸受体作为配体诱导的转录因子形成RAR/RXR异二聚体,与维甲酸反应元件(RA response elements, RAREs)结合而启动下游分化相关基因的转录。然而随着研究的深入,有研究人员发现RA在诱导细胞分化的过程中能够促使维甲酸受体α(RARα)发生泛素蛋白酶体依赖的降解,本实验室的前期研究也已表明,RARα的这种泛素化降解并不利于ATRA分化诱导作用的充分发挥,而采用蛋白酶体抑制剂如MG132及PS341等能有效逆转ATRA引起的RARα下调,并协同ATRA促进细胞分化。因此探讨RARo泛素化降解的调控机制有望为寻找基于RA的分化疗法疗效的增强提供全新的突破方向。本研究将以ATRA诱导细胞分化过程中的相关分子现象为出发点,围绕蛋白质的翻译后修饰及蛋白-蛋白相互作用等两个层面,从三个方向寻找及探讨RARα泛素化降解过程的调控因子：一、RARα的sumo-1修饰对其泛素化降解的影响。已有文献表明,RARα可以被sumo-1修饰,而sumo-1已被证实能够通过多种分子机制以不同方式调控蛋白质的泛素化降解过程,因此sumo-1是否及如何参与调节RARα的泛素化降解是本课题所要深入研究的内容之一；二、E2F1调控RARα泛素化降解的作用研究。细胞内重要的转录因子E2F1通过其转录活性调控下游蛋白的表达,参与调节细胞内诸多分子事件。而我们的初步研究表明,E2F1能够调控RARα的蛋白水平,却并不影响其mRNA水平,因此在这一部分中我们将深入研究E2F1是否具有调控RARα泛素化降解过程的作用；三、MDM2介导RARα泛素化降解的机制研究。蛋白的泛素化降解过程是一个由多种酶参与调控的有序过程,而泛素E3连接酶是整个过程中至关重要的因子,其直接决定了降解过程的靶向性及准确性,在蛋白质的泛素化降解过程中处于中心环节。我们的初步研究表明,具有泛素E3连接酶活性的蛋白MDM2可能具有促进RARα泛素化降解的功能,因此本部分的研究我们将基于前期的初步研究结果,探讨MDM2是否可能为RARα的泛素E3连接酶。第一部分RARα的sumo-1修饰对其泛素化降解的影响目的：RARα在其配体RA作用下通过与其他信号分子的相互作用调控与细胞生长、分化、存活及死亡等相关的诸多分子事件,被认为是最重要的维甲酸受体之一。已有研究表明,RARα在RA作用过程中发生泛素化降解,然而对于RA通过何种分子机制促进RARα的泛素化降解却鲜有报道。小泛素样蛋白sumo-1于近年来被证实能够共价修饰在细胞生命活动中起重要作用的多种蛋白质,并在调节蛋白稳定性方面发挥着重要而复杂的作用。本文将以ATRA作为工具药,系统研究RARα的sumo-1修饰在其泛素化降解及细胞分化过程中的作用。方法与结果：在已有文献报道RARα能够被sumo-1修饰的基础上,我们通过对RARcα蛋白编码区氨基酸序列进行分析后发现,第399位赖氨酸完全符合已被证实能够与sumo蛋白结合的赖氨酸的特点,因此第399位赖氨酸可能为RARα上sumo-1的结合位点。基于此,我们通过点突变技术将编码第399位赖氨酸的密码子进行了突变,使其转而编码精氨酸,得到RARα-K399R的突变质粒,并进一步采用免疫沉淀及Western blotting的方法在COS7细胞中证实第399位赖氨酸的突变显著减弱了RARα的sumo-1修饰水平,因此我们认为,第399位赖氨酸确实为RARα的sumo-1修饰位点。另一方面,我们发现ATRA在促进RARα泛素化降解的过程中伴随着sumo-1蛋白及与sumo-1结合的RARcα蛋白的下调,提示sumo-1可能参与RARα泛素化降解过程的调控。进而我们对比了野生型RARα (RARα-WT)及第399位赖氨酸突变的RARα(RARα-K399R)在蛋白稳定性及泛素化降解过程中的差异。Western blotting结果显示,采用CHX抑制蛋白的合成后,RARα-K399R的降解速度显著高于RARα-WT,而第399位赖氨酸突变后,ATRA也同样能增强RARα的泛素化水平并加速其降解。荧光素酶双报告基因检测系统及Real Time RT-PCR实验则进一步证实在ATRA作用下RARα-K399R的转录活性显著低于RARα-WT。同时,我们采用siRNA干扰技术对细胞内的sumo-1进行了敲除,结果表明,sumo-1的低表达显著降低了RARα的稳定性及ATRA诱导的RARα转录激活水平。在此基础上,我们采用流式细胞术对已转染RARα-WT或RARα-K399R的HL60R细胞经ATRA诱导后细胞表面抗原CD11b的表达进行了检测,结果发现,不同于RARα-WT, RARα-K399R并不能促使HL60R细胞发生分化。而Western blotting结果也证实,敲除U20S细胞中的sumo-1后,ATRA诱导的U20S细胞分化被显著抑制。结论：RARα的sumo-1修饰拮抗其泛素化降解,并促进了RARα的转录激活及ATRA诱导的细胞分化,对于RARα泛素化降解调控机制的研究是一个有益的补充。第二部分E2F1调控RARα泛素化降解的作用研究目的：E2F1是细胞内重要的转录因子,通过其转录活性转录激活下游一系列与细胞生长、凋亡及分化相关的蛋白的表达,在细胞生命活动中起着中心调节作用。随着研究的深入,其不依赖于下游蛋白的转录激活而对靶蛋白的调控作用也越来越得到研究者的关注。我们的初步研究证实,E2F1可能参与调控RARα的泛素化降解过程。在本部分研究中,我们将在前期研究的基础上在骨肉瘤U2OS细胞中深入探讨E2F1调控RARα泛素化降解的作用,以期发现RARα泛素化降解过程的全新调控因子及不依赖于E2F1转录激活而受其调控的靶蛋白。方法与结果：首先,我们采用免疫组化技术对多例骨肉瘤临床样本中的RARα及E2F1蛋白表达情况进行了检测。结果发现RARc(?)在约71.4%的骨肉瘤中呈阴性表达,而E2F1在约86.5%的骨肉瘤中呈阳性表达,且两者表达水平呈一定的负相关,SPSS软件计算其相关系数为-0.402。这一结果提示,E2F1与RARα司可能存在一定的调控作用。为深入研究这一作用,我们在U20S细胞中分别采用脂质体转染或siRNA干扰技术增加或减少了细胞内E2F1的表达。Western blotting及Real Time RT-PCR结果显示,E2F1高表达促进RARα的下调,而E2F1低表达则上调RARα,且这一作用并不依赖于RARα mRNA水平的改变。进一步地,我们发现蛋白酶体抑制剂MG132显著逆转E2F1高表达引起的RARα下调,而高表达E2F1则明显降低RARα蛋白的稳定性,缩短其半衰期。同时我们采用免疫沉淀技术证实下调细胞内E2F1蛋白表达抑制了ATRA引起的RARa蛋白的多聚泛素化。以上结果均表明,E2F1能够通过影响RARa的泛素化降解过程调控细胞内RARa蛋白水平。而荧光素酶双报告基因检测系统及Real Time RT-PCR实验则证实E2F1在调控RARα稳定性的基础上负性调控了ATRA诱导的RARα转录激活。另一方面,通过免疫荧光技术我们发现U20S细胞中内源性的E2F1与RARcα存在一定的共定位,而免疫沉淀及GST-pull down技术则进一步证实E2F1与RARα在体内外均能发生相互结合。在此基础上,我们构建了多个不同功能区域缺失的E2F1质粒突变体,并将其分别与RARcα共转染至COS7细胞中,免疫沉淀结果显示E2F1蛋白上的第191-379位氨基酸所在结构域可能为RARα在其上的结合区域。Western blotting结果则表明当缺失191-379位氨基酸后,E2F1促进RARα下调的作用消失,即E2F1促进RARα降解依赖于两者的直接结合。基于E2F1对RARα泛素化降解过程的调节作用,我们对E2F1在ATRA诱导的U20S细胞分化过程中的作用进行了研究。结果表明,E2F1依赖于与RARα蛋白的结合负调控ATRA诱导的U2OS细胞分化。而进一步地,我们发现E2F1在原代骨肉瘤细胞中的表达水平也在一定程度上决定了原代骨肉瘤细胞对ATRA的敏感性。结论：E2F1通过与RARα蛋白的结合调节RARα的泛素化降解过程,并进一步负调控其转录活性及ATRA诱导的骨肉瘤细胞分化。第三部分MDM2介导RARα泛素化降解的机制研究目的：在前两部分的研究中,我们发现了两个RARα泛素化降解过程的可能调控因子,而蛋白质依赖于泛素蛋白酶体通路的降解是一个由多种酶介导的复杂而有序的分子过程。其中泛素E3连接酶在整个过程中起着中心调节作用,其通过特异性地识别靶蛋白决定着整个过程的精确性。因此寻找RARα泛素化过程的泛素E3连接酶对于更好地理解RARα泛素化降解过程的调控具有积极的推动作用。在前期能与RARα结合的蛋白的筛选过程中,我们发现了MDM2这一细胞内重要的泛素E3连接酶,因此本部分的研究我们将在确定MDM2能够促进RARα泛素化降解的基础上致力于探讨MDM2是否可能为RARa的泛素E3连接酶。方法与结果：我们在U20S细胞中采用ATRA作用后,细胞内RARcα蛋白发生时间依赖性下调。同时我们发现出核抑制剂LMB能够显著逆转ATRA引起的RARa蛋白下调,即ATRA诱导的RARa泛素化降解发生于细胞质中。Western blotting及免疫荧光实验则证实,ATRA短时间处理U2OS细胞后,细胞内MDM2蛋白发生上调,并在细胞质中累积,这一结果提示MDM2可能与ATRA触发的RARa泛素化降解有关。为了深入研究这一作用,我们在U2OS细胞中过表达了MDM2蛋白,Western blotting结果显示,MDM2依赖于其泛素连接酶活性促进RARα蛋白下调,而这一作用在ATRA处理后更甚。同时我们构建了MDM2稳定低表达的U20S细胞株,并对其中RARα蛋白水平进行了检测。结果表明,MDM2低表达上调了RARcα蛋白水平,并增强了其蛋白稳定性。进一步研究显示,MDM2高表达促进了ATRA引起的RARα多聚泛素化水平,而低表达则反之。同时体外泛素化实验证实,MDM2的泛素连接酶活性在RARα的多聚泛素化过程中是不可或缺的。另一方面,我们采用免疫荧光技术发现内、外源性的MDM2及RARα均存在一定的共定位,免疫沉淀结果则进一步证实MDM2能与RARα发生相互结合,并且ATRA能够促进两者的结合。在此基础上,采用免疫沉淀技术我们发现MDM2蛋白上第1-109位氨基酸所在的结构域为RARcα蛋白的结合位点,而同样能够结合于MDM2蛋白该结构域的小分子化合物Nutlin-3则能显著干扰MDM2-RARα的结合。同时,Western blotting结果证实,缺失RARα结合结构域的MDM2蛋白不能促进RARα的下调,而Nutlin-3则能够显著逆转ATRA引起的RARα蛋白下调,提示MDM2促进RARα泛素化降解的作用依赖于与RARcα蛋白的相互结合。基于MDM2对RARα蛋白的负性调控,我们对MDM2在ATRA诱导的U20S细胞分化过程中的作用进行了研究。结果表明,高表达MDM2抑制了ATRA引起的U2OS细胞生长抑制. OPN、RUNX2、ALP等分化标记蛋白的上调及细胞内ALP活性的增加,即过表达MDM2抑制ATRA诱导的U2OS细胞分化,而低表达MDM2则相反。同时,MDM2泛素连接酶活性抑制剂HLI373被发现能够显著上调RARα蛋白,降低其由ATRA引起的多聚泛素化水平,并协同ATRA增强U2OS及原代骨肉瘤细胞的分化水平。结论：MDM2通过与RARα蛋白的结合并依赖于泛素连接酶活性介导RARα的泛素化降解,可能为RARα的泛素E3连接酶。