喉癌是一种常见的上呼吸道恶性肿瘤。在前期研究工作中,分子细胞遗传学研究结果表明原发性人喉鳞状细胞癌组织中存在无功能的或突变的p53基因。我们以往的研究也表明冬凌草甲素(oridonin)具有很强的抗肿瘤活性,可以选择性杀伤多种肿瘤细胞而对人正常的外周血单核细胞基本没有影响。鉴于p53突变的细胞对凋亡有抑制作用,对许多化疗药物敏感性低,这种现状促使我们考察药用植物来源的冬凌草甲素的抗喉癌作用情况及其相关机制,以寻找更有效、副作用小的抗肿瘤药物,改善喉癌患者的生存状况。结果表明冬凌草甲素作用p53蛋白缺失的人喉鳞状细胞癌HEp-2细胞后可以诱导明显的细胞凋亡与G2／M期阻滞。冬凌草甲素通过增加Bax/Bcl-2比率,降低线粒体膜电位(Δψm),同时减少凋亡诱导因子(AIF)及细胞色素c表达的方式启动HEp-2细胞的线粒体凋亡途径。有趣的是,抑制caspase-9并没有逆转冬凌草甲素诱导的HEp-2细胞凋亡,同时发现caspase-9前体没有被裂解,提示凋亡的发生通过caspase-9非依赖的途径。伴随cyclin B1,cdc2和cdc25c蛋白表达下调,以及p21,phospho-cdc2和phospho-cdc25c表达上调,冬凌草甲素诱导HEp-2细胞发生G2／M期阻滞。我们的结果也表明冬凌草甲素通过p53独立而p21/WAF1依赖的方式介导凋亡与G2／M期阻滞。此外,活性氧(ROS)清除剂NAC和CAT完全逆转了冬凌草甲素诱导的G2／M期阻滞和凋亡,提示ROS在此过程中扮演至关重要的角色。在多数表皮来源的肿瘤中,包括人喉鳞状细胞癌中,表皮生长因子受体(EGFR)均被异常激活。据报道,EGFR抑制剂能够引起肿瘤细胞的生长抑制并且能够增强一些抗癌药物的细胞毒活性,因此抑制EGFR能否增强冬凌草甲素诱导的HEp-2细胞凋亡就成为我们关注的焦点。研究发现,冬凌草甲素作用于HEp-2细胞对EGFR表达无影响,然而却抑制其活性形式phospho-EGFR的蛋白表达,表明冬凌草甲素对EGFR介导的信号途径具有抑制作用。而且EGFR特异性酪氨酸激酶抑制剂AG1478增强冬凌草甲素诱导的HEp-2细胞凋亡,表现为进一步上调Bax, FADD,活性形式的caspase-8以及活性形式的caspase-3蛋白表达,同时进一步下调Bcl2和SIRT1的表达,此外,冬凌草甲素与AG1478联合使用增强了AIF的核转位。在我们的体系中,正是上游活性形式的caspase-8而不是caspase-9激活了下游的caspase-3,最终导致PARP及ICAD裂解而发生凋亡。此外,活性氧清除剂NAC完全阻止了AG1478与冬凌草甲素联合作用所引起的ROS产生、Δψm溃散以及与凋亡相关的蛋白的变化,提示ROS在抑制EGFR信号途径增强HEp-2细胞对冬凌草甲素敏感性方面发挥至关重要的作用。总之,抑制EGFR信号途径通过扩大ROS产生,同时激活内、外源凋亡途径的方式增强冬凌草甲素诱导的HEp-2细胞凋亡。因此,针对EGFR同时联合其他传统的抗癌药物有望成为治疗喉癌的有效策略之一。众所周知,caspase-9在凋亡过程中扮演至关重要的角色。然而,在我们的研究中,caspase-9特异性抑制剂(caspase-9 inhibitor, C9i)不但不能够保护冬凌草甲素诱导的细胞凋亡,反而增强了HEp-2细胞对冬凌草甲素作用的敏感性,这一有趣的现象促使我们进一步深入研究caspase-9信号途径在冬凌草甲素诱导的HEp-2细胞凋亡中所发挥的作用及其相关机制。结果表明,C9i通过扩大冬凌草甲素诱导的ROS产生而增强冬凌草甲素诱导的HEp-2细胞凋亡,提示caspase-9对ROS的抑制作用。此外,我们发现冬凌草甲素同时诱导HEp-2细胞发生自噬,自噬的特异性抑制剂3-MA抑制了自噬促进冬凌草甲素诱导的细胞凋亡,提示自噬具有对抗凋亡、保护细胞的功能。我们进一步考查了caspase-9在冬凌草甲素诱导自噬中的作用,结果发现抑制caspase-9降低了自噬。因此,caspase-9促进自噬从而对抗细胞凋亡可能是其发挥保护性机制的原因之一。随后,我们进一步采用RNA干扰的方法直接评价caspase-9缺失后细胞对冬凌草甲素作用的反应。与C9i的作用结果相一致,caspase-9缺陷的HEp-2细胞对冬凌草甲素的敏感性增强。综上所述,C9i抑制酶活性,而caspase-9特异性siRNA则抑制酶蛋白的表达,本研究从酶蛋白调节的两个重要方面证实caspase-9在冬凌草甲素诱导的HEp-2细胞凋亡中具有保护性作用机制。因此,联合使用冬凌草甲素及那些导致caspase-9蛋白表达降低的药物有望成为治疗喉癌的一种新的、有效的途径和方式。