MicroRNA(miRNA)是一类分布广泛，大小约为22个核苷酸的内源性非编码RNA，参与基因的转录后调控。部分miRNA基因分布在基因组中的基因间区，而另一些miRNA基因位于蛋白编码基因的内含子中。目前，对miRNA基因转录的了解仍十分有限，而对位内含子区域的miRNA及其与宿主基因的转录关系，更是知之甚少。有意思的是，有些miRNA基因位于宿主基因的可变剪接区域。其中，由于宿主基因的可变转录起始位点，果蝇miR-281-1/2基因位于宿主ODA基因的内含子区或5UTR区。本论文主要研究了miR-281-1/2的转录，探讨了位于内含子区的miRNA与其宿主基因可变转录起始位点之间的关系，并进一步开展了miRNA基因的启动子分析。本项研究对更好地理解miRNA基因的转录调控，具有重要的意义。 一、果蝇miR-281基因的转录及全长分析 RT-PCR成功扩增出miR-281-1/2的前体，进一步利用RACE技术克隆了miR-281的全长。RACE结果表明，miR-281可能有3个转录起始位点，分别为TSS1，TSS2和TSS3。TSS1上游350bp有一个TATA盒，所有转录本具有相同的3端，并在3端有多核腺苷酸加尾信号(AATAAA)。实验证实，miR-281并不是从宿主基因ODA基因的内含子区加工形成，而是具有自身的独立转录本。通过与UCSC基因组数据库比对，发现三个转录起始位点的保守性均比较高。 二、miR-281的二级结构，靶标预测和分子进化分析 Dme-miR-281基因属于mir-46家族，包括两个前体，四个(三种)成熟体。两前体在茎区只有一个核苷酸的差异，而环区有13个核苷酸的差异。MiRBase中dme-miR-281有7个同源基因，对应于8个miRNA基因成熟体，分别属于6个物种。 利用RNAfold和Mfold软件，分别对miR-281-1/2的前体和初级转录本的二级结构进行了预测，证实三个初级转录本均可形成茎环结构。利用PicTar和miRanda软件预测miR-281-1/2的靶标，发现miR-281-1有83个靶标mRNA基因，miR-281-2有69个靶标mRNA基因，miR-281-1和miR-281-2拥有共同的61个靶标基因。 UCSC数据库比对结果证实，其他16个物种中存在dme-miR-281的同源序列，但miR-281前体的重复事件只发生在黑腹果蝇及其近缘物种中(果蝇科)。利用MrBayes构建分子系统进化树发现，miR-281-1和miR-281-2处于两个不同的分支。 三、miR-281的表达谱及与ODA基因选择性剪接的关系 利用RT-PCR的方法研究了ODA基因3个剪切变体和miR-281在不同龄期的表达谱。结果表明，3个剪切体RA，RB，RC在果蝇的每个龄期都表达，而miR-281仅在3龄幼虫，蛹和成虫期表达，荧光定量PCR结果表明，RA和RC的丰度较高，在各个龄期的变化很大。RB和miR-281的表达量较低，miR-281在不同龄期没有明显的区别。这些结果表明，ODA基因的可变转录起始位点对处于其内含子区的miR-281的转录没有明显的影响。EST分析的结果与定量PCR相对表达量的结果一致，匹配到RA和RC的EST远远多于RB和miR-281。 四、miR-281基因的启动子及Myc转录因子的免疫共沉淀分析 利用TRANSFAC数据库预测发现，TSS1，TSS2和TSS3附近有重要的转录因子结合位点如：Myc，C/EBP，CAD等等。TSS1上下游有两个Myc结合位点。通过染色质免疫共沉淀实验，证明Myc结合于miR-281基因启动子区，可能参与miR-281的转录调节，这也间接证明了miR-281的独立转录。UCSC数据库比对结果显示，两个Myc转录因子结合位点的保守性较高。 将TSS1上游1020 bp及下游412 bp的区域作为可能的启动子区，构建了pMiR-281-GFP载体，转染果蝇S2细胞，并利用CuSO4促进转录表达，结果未能发现明显的绿色荧光。分析可能存在多个原因，一是miR-281启动子的启动效率太低，以致观察不到GFP发出的荧光；二是果蝇S2细胞不表达miR-281；三是选择构建载体的启动子区域不是真正的启动子区。 五、多重转录起始位点的转录效率分析 利用随机引物进行反转录的cDNA为模板，进行定量PCR来分析miR-281基因不同转录起始位点的转录效率。在3龄幼虫期，与转录本1比较，转录本2是转录本1的0.97倍，在成虫期，转录本2是转录本1的0.83倍。这一结果表明，TSS1和TSS2具有相似的转录效率。转录本3在3龄幼虫期和成虫期分别是转录本1的4.34倍和1.33倍，表明TSS3的转录效率比TSS1和TSS2都高，但TSS3随着果蝇的不同发育阶段，转录效率有所变化。