苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)是多角体杆状病毒科的典型代表，能感染30多种鳞翅目昆虫，该病毒的基因组是由大小为134kb的环状单一双链DNA分子组成。感染宿主后的核型多角体病毒有两种表型：一种为包涵体病毒(ODV)，另一种则为非包涵体病毒(BV)。目前只在BV颗粒中发现Gp64蛋白，分子量为64kD。Gp64蛋白是第三类过滤性的膜融合蛋白，主要以二硫键相连三聚体的形式存在于杆状病毒BV的一端，在病毒感染的早期和晚期均能表达这个蛋白，它是病毒进入宿主细胞的关键功能蛋白之一。Gp64蛋白作为杆状病毒BV上的囊膜蛋白，在内吞途径进入细胞中，对结合宿主细胞受体和调节低pH引发膜融合有重要作用。同时Gp64蛋白也是病毒萌芽和后代产生所必需的。本实验将Gp64基因克隆到原核表达系统中，得到重组Gp64蛋白，利用纯化的Gp64蛋白通过免疫大白兔实验获得了Gp64蛋白抗体，用来检测Gp64基因在酵母细胞中的表达。1．苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64基因在大肠杆菌中的表达：以AcMNPVBacmid质粒为模板，参照NCBI上所给出的Gp64蛋白基因组序列，设计一对引物，并在其上下游分别添加EcoR I和Sal I酶切位点。 PCR扩增出全长的Gp64基因。所得的PCR产物经测序验证后用EcoR I和Sal I酶切后与经EcoR I和Sal I酶的同尾酶Xba I酶同样处理的pET28a(+)原核表达载体连接，命名pET28a-Gp64。挑取阳性克隆，抽提质粒，经酶切鉴定和测序验证后，转化到于E.coli野生型BL21表达菌中，利用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE检测Gp64蛋白基因在大肠杆菌中没有表达。2．苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒截短Gp64基因在大肠杆菌中的表达：以AcMNPV Bacmid质粒为模板，参照NCBI上给出的Gp64全基因组序列及已报到跨膜区域的相关序列来切除下游跨膜区域以确定截短序列。采用与之前相同的方法设计引物，添加相同的酶切位点，PCR扩增后得到截短Gp64基因，PCR产物和pET28a(+)原核表达载体通过酶切后进行连接反应，重组子命名为pET28a-截短Gp64。挑取阳性克隆，抽提质粒，经酶切鉴定和测序验证后，转化到于E.coli野生型BL21表达菌中用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE检测Gp64基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白大小约为40kD。对目的蛋白表达条件进行优化，对收获的目的蛋白进行电透析纯化，得到纯度较高的目的蛋白，割胶免疫大白兔，收获Gp64蛋白抗体。3．苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64基因在酿酒酵母中的表达：以AcMNPVBacmid质粒为模板，参照NCBI上给出的Gp64蛋白基因组序列，设计一对引物，并在其上下游添加了EcoR I和Sal I酶切位点，PCR扩增后得到Gp64基因。所得的PCR产物用EcoR I和Sal I酶切后与经相同酶处理的pGBKT7酵母表达载体进行连接反应，得到的重组子命名pGBKT7-Gp64。挑取阳性克隆，抽提质粒，经酶切鉴定和测序验证后，转化到于酿酒酵母表达菌AH109中进行营养缺陷性筛选，对筛选出来的菌落进行菌落PCR检测。对所得的目标菌株及对照菌株进行SDS-PAGE和Western-Blotting分析。综上所述，本试验利用大肠杆菌表达系统和酿酒酵母表达系统分别进行了杆状病毒AcMNPV囊膜蛋白Gp64基因的表达，为进一步研究对该病毒感染过程中的Gp64蛋白的表达检测提供了检测试剂：Gp64抗体。