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研究目的:本研究将探索生物钟基因Period2(简称Per2)对人肺癌A549细胞的增殖和凋亡能力的影响,并进一步研究其分子机制,发现Per2基因在肿瘤细胞中的生物学功能。 研究方法:1.体外实验:应用平板克隆形成实验、MTS检测法和流式细胞技术检测Per2基因对A549细胞克隆增殖能力和凋亡情况的影响;应用Hoechst33258染色法观察Per2基因对A549肺癌细胞凋亡形态的影响;进一步应用Western Blot和Real Time PCR技术检测增殖凋亡相关基因表达水平。2.体内动物实验:通过裸鼠皮下成瘤实验研究Per2对A549细胞成瘤率、肿瘤生长情况的影响,进一步检测皮下移植瘤中细胞凋亡情况;运用免疫组化技术检测皮下移植瘤中Per2和Ki-67表达水平。 实验结果:1.平板克隆形成实验和MTS细胞增殖实验结果显示,Per2基因对A549细胞平板克隆形成能力、细胞增殖活性均有明显抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05)。2.流式细胞术检测发现,与对照组比较,Per2过表达的细胞G1期明显增加,S期相对减少;Per2基因过表达的A549细胞凋亡率高于对照组,分别为(23.27±3.37)%和(14.30±4.57)%。3.实时荧光定量PCR(real time PCR)和蛋白印迹(western blotting)检测结果显示,与对照组相比,Per2基因过表达的A549细胞中P53、P21、Bax、Caspase8等基因的mRNA和蛋白表达增加,而c-Myc、Bcl-2表达降低。4.动物实验结果显示:两组裸鼠的成瘤率均为100%,但Per2过表达组皮下移植瘤生长速度较对照组明显缓慢,瘤体重量也较对照组轻,差异均有统计学意义(P<0.05)。Per2基因对A549细胞裸鼠体内的成瘤性抑制率为63.56%。5.皮下移植瘤凋亡细胞检测发现,Per2过表达组和对照组细胞凋亡率分别为(9.45±3.57)‰、(3.66±1.27)‰,差异有统计学意义(P<0.05);免疫组化结果显示,过表达组的Per2免疫反应积分(immunoreactivescore,IRS)明显高于对照组,分别为(6.38±2.504 VS3.12±2.232)分,差异有统计学意义(P<0.05);Per2过表达组中Ki-67阳性细胞百分率低于对照组,分别为(40.62±12.082 VS71.25±6.409)%,差异有统计学意义(P<0.05)。 实验结论:Per2基因过表达对人肺癌A549细胞的体外生长和裸鼠体内的移植瘤生长均具有显著抑制作用,并且能够诱导其凋亡;其作用的分子机制可能与Per2基因上调P53、P21、Bax、Caspase8的表达,下调c-Myc、Bcl-2、Ki-67表达有关;其详细作用机制还需进一步研究。