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研究目的:TBI(traumatic brain injury)致残致死率高,严重威胁国人健康。尽管近年来TBI救治水平已有显著提高,但IBI的死亡率仍然维持在较高水平,亟需寻找更为有效的救治方法。TBI后神经功能异常,主要与神经元死亡以及神经功能网络丧失有关。重建神经细胞稳态,碱少神经细胞死亡和神经网络联系的破坏,恢复神经细胞间的功能联系,是突破其救治“瓶颈”的重要途径。近年来,内质网和线粒体的交互作用,作为细胞稳态调控的关键亚细胞反应,因其在细胞重建稳态、抵御损害、保证存活中发挥重要作用,而备受国内外学者的关注。内质网与线粒体之间的膜接触位点称为MAMs(Mitochondria-associated membranes),它是内质网与线粒体交互作用的主要功能单位。在阿尔兹海默病,脊髓侧索硬化等神经退行性疾病的研究中发现位于MAMs上多种蛋白参与神经细胞内的脂质代谢和钙信号传导、炎症反应等多种病理生理过程。在此实验中,我们旨在探究脑外伤后内质网和线粒体的交互作用的变化规律及其病理生理机制,以期为脑外伤的救治提供有效的理论支持。研究方法:1.CCI(Controlled cortical impact)制备小鼠IBP模型及IBI后小鼠脑组织HE染色;2.电镜观察TBI后小鼠脑组织中内网与线粒体交互作用的变化规律;3.通过免疫荧光染色及Westem blot检测mfn2,PACS2表达量的变化,这两个蛋白是调控内质网与线粒体交互的关键因子;4.通过Westem Blot检测MAMs上钙通道蛋白IP3R1、σσ-1R、GRP75、VDAC1表达量的变化;5.TBI后通过Western Blot检测Bcl-2/B ax比值及Cytc表达量的变化来观察MAMs与线粒体功能障碍之间的关系;6.通过Westem Blot检测内质网应激通路P-perk-P-eif2α-AIF4及GRP7S的变化;7.通过Western Blot检测内质网应激通路下游的调亡蛋白Chop及Caspa se-12的变化明确MAMs对内质网应激的影响;8.通过Western Blot及DCFH-DA探针检测炎症因子IL-1β,TNF-α表达及ROS的变化规律。研究结果:脑外伤后MAMs形成先减少后迅速增加,于伤后6、时达到高峰,之后逐谳下降;MAMs上的钙通道蛋白IP3R1/σ-1R/GRP75/VDAC1的电泳结果表明两者交互作用增强时,内质网与线粒体之间形成稳定的Ca2-通道,Ca2-运作用增强;对于引起线粒体通透性改变的蛋白Bcl-2/Bax及Cytc测定发现,Ca2-转运作用增强后导致线粒体内Ca2-平衡破坏进而引起线粒体功能障碍及线粒体通透性改变;内质网应激通路蛋白P-perk-P-eif2α-ATF4及GRP78表达量的变化表明当MAMs形成增多时不经导致线粒体功能障碍,还会导致内质网应激通路的激活;进一步检测内质网应激通路下游凋亡蛋白Chop及Caspase-12的表达变化显示两者交互作用的增强可导致内质网应激通路的激活,进而引起细胞凋亡;从炎症因子IL-1β,TNF-α达及ROS检测结果发现MAMs不仅对于脑外伤后神经细胞凋亡有重要影响,而且在伤后早期炎症因子的激活及氧化应激的发生中也意义重大。研究结论:综合以上数据表明在脑外伤早期内质网与线粒体交互作用加强,MAMs形成增多,内质网与线粒体之间的Ca2+转运作用增强,Ca2+平衡破坏导致线粒体功能障碍及线粒体通透性改变,同时可导致内质网应激通路的激活,凋亡因子释放;此外MAMs不仅对于脑外伤后神经鈿胞凋亡有重要影响,而且在伤后早期炎症因子的激活及氧化应激的发生中也意义重大。