论文部分内容阅读
心肌再生能力十分有限,一旦受损常由瘢痕组织所替代。心肌细胞移植和心脏组织工程为恢复受损心肌的功能带来了新的曙光。在所有可供心肌移植的种子细胞中,脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs)具有其他干细胞不具有的独到优势,有望成为心肌修复最理想的干细胞之一。虽然有关ADMSCs研究较多,但仍存在如下问题：①体外培养的ADMSCs尚未发现其特异的标记分子；细胞衰老与ADMSCs培养时间的关系尚不清楚；有关间充质干细胞超微结构的研究较少。②ADMSCs是非均质的细胞群,不同亚群生物学特性的差异限制了ADMSCs的应用效果。因此,纯化ADMSCs不同亚群研究其生物学特性,对提高其研究的针对性和细胞治疗效果十分必要。③ADADMSCs具有分化成心肌细胞的潜能,虽然目前已对心肌分化的分子调控机制有一定的了解,但并不明确哪种单一或哪些联合的基因能启动ADMSCs重新编程向功能性心肌分化。本研究首先从细胞形态学特点、表面标记、多向分化潜能细胞衰老情况以及超微结构等方面,对分离培养的ADMSCs进行鉴定与评价；然后分离纯化CD73+和CD73-ADMSCs,探讨两个亚群的生物学特性和向心肌分化潜能的差异,筛选出心肌分化优势亚群：最终对优势亚群进行基因修饰,从基因和蛋白水平证明Gata4、Tbx5和Baf60c三种基因对ADMSCs向心肌分化的作用。本研究旨在为心肌组织工程和体外细胞模型奠定细胞学基础,为探讨心脏发生、发育的分子机制提供理论依据,为进一步开展细胞治疗心肌疾患提供实验参考。1.分离培养的ADMSCs符合MSCs鉴定标准小鼠ADMSCs的形态呈多样性,表达CD73、CD90和CD105,不表达CD45,体外分离培养的ADMSCs具有成心肌、成脂肪和骨细胞的多向分化潜能,符合干细胞鉴定标准,可作为进一步研究的细胞源。2. ADMSCs衰老率与传代次数和培养时间正相关为了确定最佳时间和利用最佳培养阶段的ADMSCs,通过描计细胞生长曲线、衰老检测、分析细胞增殖周期和电镜观察,证明了随着培养代次的增加和培养时间延长,细胞衰老率升高；G0/G1期细胞所占比例升高,S期和G2/M期细胞所占比例明显降低,提示细胞分裂增殖速度减慢；培养P8细胞形态不规则,细胞膜表面有少数较大的突起和较多的微突,细胞核位于细胞中央或偏于一侧,细胞质内存在大量脂滴、Golgi器和较多的自噬体,因此,应用ADMSCs时应充分考虑细胞代次和培养时间,研究ADMSCs时应使用八代以内处于对数生长期的细胞。3.CD73+亚群是ADMSCs中较幼稚的细胞群,具有较高的心肌分化潜能用流式细胞仪分选CD73+/CD73-亚群,CD73+ADMSCs形态以小细胞为主,主要包含RS细胞和SS细胞,表达CD73、CD105和CD90；而CD73-细胞以FC细胞为主,不表达CD73、表达CD105和CD90。基因和蛋白水平上CD73+亚群较CD73-亚群均高表达Nanog。CD73+/CD73-两个亚群均具有成骨、成脂和成心肌的分化能力,成骨和成脂分化定量上差异无统计学意义,但CD73+较CD73-细胞具有更高地向心肌分化的潜能。两个亚群移植到大鼠心脏后,进一步证明CD73+ADMSCs心肌转分化率显著高于CD73"组。这些结果提示CD73+ADMSCs具有更好的心肌治疗前景。4.Gata4、Tbx5和Baf60c基因修饰促进CD73+ADMSCs心肌标志基因cTnT和心肌相关基因表达成功构建了Gata4、Baf60c和Tbx5过表达慢病毒载体。实验分组：CD73+ADMSCs组(Con)；转染阴性对照病毒组(NC)；转染Tbx5组(OE1)；转染Gata4和Baf60c组(OE2)；转染Gata4、Baf60c和Tbx5组(OE3)。Tbx5-GFP-LV、Gata4-LV、Baf60c-LV感染CD73+ADMSCs,细胞化学和Real-time PCR结果证实(?)Gata4、Baf60c和Tbx5均高表达,证明本研究基因转染成功。基因转染CD73+ADMSCs2w,细胞免疫荧光结果OE2和OE3组表达心肌特异性蛋白cTnT,流式细胞仪检测OE3组cTnT表达率5.71%。RT-PCR检测基因转染CD73+ADMSCs后7d与14d,心肌相关基因以及干细胞标志基因Nanog的表达,结果显示：Nanog在Con和NC组持续表达,而OE1、OE2和OE3组不表达,说明基因转染细胞后,ADMSCs具有分化倾向；Nkx2.5是心肌分化早期的标志性基因,NC、 OE1不表达,OE2和OE3在基因转染ADMSCs7d两组均开始表达,ADMSCs启动心肌分化；cTnT、Myh6和Actcl是心肌分化晚期的标志基因,基因转染ADMSCs7d各组均不表达,转染14d后OE3表达cTnT, Myh6和Actcl,OE2表达cTnT和Myh6。5.Gata4、Tbx5和Baf60c基因促进CD73+ADMSCs分化为搏动性心肌细胞Gata4、Tbx5和Baf60c基因转染第8天,活细胞工作站观测到OE3组出现细胞搏动,搏动细胞均带有绿色荧光,搏动频率在80～120次／分。本研究结果表明,体外分离培养的ADMSCs具有成心肌、成脂肪和骨细胞的多向分化潜能；CD73+亚群是ADMSCs中较幼稚的细胞群,具有较高的心肌分化潜能；Gata4、Tbx5和Baf60c三种因子的结合建立了成体ADMSCs向心肌分化的调控机制,CD73+ADMSCs在三种基因的诱导下可以分化为诱导心肌细胞(induced Cardiomyocytes, iCMs),表现出自主搏动性,其中Gata4和Baf60c是决定心肌分化的关键基因,Tbx5是决定心肌搏动功能基因。