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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一,好发于东南沿海地区,其死亡率居所有恶性肿瘤第三位。根据世界卫生组织于2014年2月3日发布的“世界癌症报告2014”显示,HCC的发病率在全球呈上升趋势,中国的HCC新增病例数与HCC相关致死病例数均居世界首位。由于HCC的病因尚不能完全阐明,并且缺乏特效的药物与治疗手段,HCC患者的预后并不理想。因此,本文探讨肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）与血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）通过对G蛋白偶联受体激酶2（G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2）表达的调节从而影响肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭具有重要的意义,可为临床医生预防和治疗HCC提供新的方向与思路。TNF-α与AngⅡ是人体中重要的生物活性因子,先前的研究已经证实二者均参与HCC的形成与进展。TNF-α主要通过肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1）和肿瘤坏死因子受体2（tumor necrosis factor receptor 2,TNFR2）发挥生物学作用。TNFR1在各种组织细胞表面均有表达,而TNFR2主要表达于免疫组织细胞中,其中TNFR1介导的生物学效应具有诱导炎症和促进凋亡的双重作用。AngⅡ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统中重要的生物学效应物,其主要作用受体为血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensinⅡtype-1 receptor,AT1R）和血管紧张素Ⅱ2型受体（angiotensinⅡtype-2 receptor,AT2R）。AngⅡ可通过AT1R发挥促血管收缩、促炎、促纤维化及促细胞增殖等多种作用,而通过AT2R则可能出现完全相反的生物学效应。G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）结构具有七次跨膜螺旋特征,其介导的多种信号通路与肿瘤细胞的生长与转移密切相关。GRK2为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族重要成员,在人体各种组织中具有广泛分布,能够特异性的磷酸化及脱敏已活化的GPCRs,从而终止GPCRs介导的各种信号转导通路。GRK2具有多种不同的病理及生理作用,其自身活性和表达也可受到多种因素的调节。课题组前期研究发现GRK2的表达在肝癌组织中随着分化水平的降低可明显下降,同时GRK2能够显著降低肝癌细胞增殖与侵袭的能力,因此GRK2在HCC的形成与进展中扮演着负性调节的角色。先前的研究发现TNF-α与AngⅡ可在内皮细胞、滑膜细胞及心肌细胞中调节GRK2的表达,并进一步影响细胞的增殖、转移和炎症反应。然而,现在尚无TNF-α、AngⅡ及GRK2在肝癌细胞中相互作用的研究报告。因此,本课题通过研究TNF-α与AngⅡ在肝癌细胞中对GRK2、TNFR1、AT1R及AT2R表达的调节作用,结合人体肝癌标本及小鼠肝癌动物模型,探讨TNF-α、AngⅡ及GRK2在肝癌形成与进展中的作用及相关机制。目的:观察TNF-α、AngⅡ、TNFR1、AT1R、AT2R及GRK2在HCC和良性肝肿瘤（benign liver tumors,BLT）患者血液与肝脏标本中的表达差异;分析TNF-α、AngⅡ及GRK2在小鼠肝癌模型造模不同时期肝脏中的表达情况;探索TNF-α和AngⅡ通过调节GRK2的表达影响肝癌细胞增殖、迁移与侵袭活性的相关机制。方法:1.收集HCC、良性肝肿瘤患者和正常体检人群的血清标本,ELISA法检测不同人群血清中TNF-α与AngⅡ的表达水平。2.收集相同数量（32例）HCC和良性肝肿瘤患者的肝脏切除标本,分别采用免疫组化法（IHC）和Western blot法检测HCC患者的肝癌与癌周组织以及良性肝肿瘤患者瘤旁的正常肝脏组织中TNF-α、AngⅡ、TNFR1、AT1R、AT2R及GRK2的表达情况。3.CCK-8法观察不同浓度的TNF-α（2.5,5,10,20,40 ng/ml）和AngⅡ(1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5 mol/l)刺激HCC细胞株（HepG2与Bel-7402,下同）12、24及48小时后细胞增殖能力的变化,并检测选定浓度的TNF-α和AngⅡ单独及联合应用刺激HCC细胞株12、24及48小时后细胞增殖能力的变化。4.细胞划痕法和Transwell法观察TNF-α与AngⅡ单独及联合应用刺激HCC细胞株24及48小时后细胞移行能力以及24小时后细胞迁移与侵袭能力的变化。5.流式细胞术（FCM）观察TNF-α和AngⅡ单独及联合应用刺激HCC细胞株48小时后细胞表面TNFR1、AT1R与AT2R表达水平的变化。6.Western blot法观察TNF-α和AngⅡ单独及联合应用刺激HCC细胞株12、24及48小时后细胞中GRK2表达水平的变化。7.GRK2 siRNA转染HCC细胞株,同时设置scrambled siRNA转染的HCC细胞株为阴性对照组。Western blot法检测GRK2表达水平在转染后的HCC细胞株中的变化,并以CCK-8法和Transwell法检测转染后的HCC细胞株增殖、迁移与侵袭能力的变化。8.CCK-8法和Transwell法检测TNF-α与AngⅡ单独及联合应用刺激GRK2 siRNA转染的HCC细胞株12、24及48小时后细胞增殖能力以及24小时后细胞迁移及侵袭能力的变化。9.二乙基亚硝胺（DEN）诱导小鼠肝癌模型,设对照组和模型组,以Western blot法检测造模不同时期（0wk、12wk、24wk和36wk）小鼠肝脏中TNF-α、AngⅡ及GRK2表达水平的变化。结果:1.TNF-α和AngⅡ在不同人群血清中的表达水平ELISA结果显示肝癌患者组血清中TNF-α和AngⅡ的表达水平明显高于良性肝肿瘤组和正常对照组,而良性肝肿瘤组和正常对照组之间血清中TNF-α和AngⅡ的表达水平无显著性差异。2.TNF-α、AngⅡ、TNFR1、AT1R、AT2R及GRK2在癌肿、癌周和正常肝脏组织中的表达水平免疫组化和Western blot结果显示癌周组织中TNF-α和TNFR1的表达明显高于肝癌及正常肝脏组织,其中肝癌组织中TNF-α和TNFR1的表达高于正常肝脏组织;肝癌与癌周组织中AngⅡ和AT1R的表达均高于正常肝脏组织,而AT2R的表达仅在肝癌组织中高于正常肝脏组织;癌周与正常肝脏组织中GRK2的表达均高于肝癌组织,但在癌周与正常肝脏组织之间GRK2的表达无显著性差异。3.TNF-α和AngⅡ对HCC细胞株增殖能力的影响CCK-8实验发现5 ng/ml TNF-α和1×10-7 mol/l AngⅡ对Hep G2细胞有明显的促增殖作用,而Bel-7402细胞则对10 ng/ml TNF-α和1×10-7 mol/l AngⅡ敏感。并以选定浓度的TNF-α和AngⅡ单独及联合应用刺激HCC细胞株,CCK-8结果证实TNF-α组、AngⅡ组和联合组均可显著促进HCC细胞株的增殖活性,其中TNF-α组促细胞增殖能力强于AngⅡ组和联合组,而AngⅡ组和联合组之间促细胞增殖能力无明显差异。4.TNF-α和AngⅡ对HCC细胞株迁移与侵袭能力的影响细胞划痕与Transwell结果证实TNF-α组、AngⅡ组和联合组均可显著促进HCC细胞株的迁移及侵袭活性,其中TNF-α组促细胞迁移及侵袭能力强于AngⅡ组和联合组,而AngⅡ组和联合组之间促细胞迁移及侵袭能力无明显差异。5.TNF-α和AngⅡ对HCC细胞株表面TNFR1、AT1R及AT2R的表达的影响流式细胞术结果证实TNF-α组细胞表面TNFR1的表达显著高于对照组、AngⅡ组和联合组,其中联合组细胞表面TNFR1的表达高于对照组和AngⅡ组,而对照组和AngⅡ组之间TNFR1的表达无明显差异;AngⅡ组和联合组细胞表面AT1R的表达显著高于对照组和TNF-α组,而AngⅡ组和联合组之间以及对照组和TNF-α组之间细胞表面AT1R的表达无明显差异;联合组细胞表面AT2R的表达显著高于对照组、TNF-α组和AngⅡ组,其中AngⅡ组细胞表面AT2R的表达高于对照组和TNF-α组,而对照组和TNF-α组之间细胞表面AT2R的表达无明显差异。6.TNF-α和AngⅡ对HCC细胞株中GRK2表达水平的影响Western blot结果显示TNF-α和AngⅡ单独及联合应用刺激HCC细胞株12小时后,对照组、TNF-α组、AngⅡ组和联合组之间细胞中GRK2的表达无明显差异;刺激HCC细胞株24小时后,TNF-α组细胞中GRK2的表达显著低于对照组,而对照组与联合组之间GRK2的表达无明显差异;刺激HCC细胞株48小时后,TNF-α组、AngⅡ组和联合组细胞中GRK2的表达均显著低于对照组,其中TNF-α组细胞中GRK2的表达低于联合组,而TNF-α组与AngⅡ组之间GRK2的表达无明显差异。7.GRK2对HCC细胞株增殖、迁移和侵袭能力的影响Western blot结果显示GRK2 siRNA转染的HCC细胞株中GRK2表达水平显著低于scrambled siRNA转染的HCC细胞株;CCK-8和Transwell实验发现GRK2si RNA转染组细胞增殖、迁移及侵袭能力明显强于scrambled siRNA转染组。8.TNF-α和AngⅡ对GRK2 siRNA转染的HCC细胞株增殖、迁移和侵袭能力的影响CCK-8结果证实TNF-α和AngⅡ单独及联合应用刺激GRK2 si RNA转染的HCC细胞株12及24小时后,对照组、TNF-α组、AngⅡ组和联合组之间细胞增殖活性无明显差异;刺激GRK2 siRNA转染的HCC细胞株48小时后,TNF-α组可显著促进细胞的增殖活性,而TNF-α组、AngⅡ组和联合组之间促细胞增殖能力无明显差异;Transwell结果证实TNF-α组可显著促进GRK2 siRNA转染的HCC细胞株的迁移及侵袭活性,而TNF-α组、AngⅡ组和联合组之间促细胞迁移及侵袭能力无明显差异。9.TNF-α、AngⅡ和GRK2在DEN诱导的小鼠肝癌模型肝脏中的表达水平Western blot结果显示对照组小鼠肝脏中TNF-α、AngⅡ和GRK2的表达随着造模时间的延长并无明显差异;模型组小鼠肝脏中TNF-α和AngⅡ的表达水平随着造模时间的延长而显著上升,而GRK2的表达水平则随着造模时间的延长而显著下降。结论:1.TNF-α和AngⅡ的表达水平在HCC患者的血清和肝脏组织中均有明显升高,且二者可增强肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭活性,提示TNF-α和AngⅡ可能是HCC形成与进展中的重要促进因子。小鼠肝癌模型肝脏中TNF-α和AngⅡ的表达水平随着肝癌造模时间的延长而显著上升,说明TNF-α和AngⅡ可能在肝癌形成的不同时期均具有重要的促进作用。2.TNF-α与AngⅡ可诱导肝癌细胞表面TNFR1、AT1R和AT2R呈差异性表达,且相关受体在癌肿、癌周与正常肝脏组织中的表达水平存在明显差异,提示TNFR1、AT1R和AT2R可能参与了HCC的形成与进展过程,其中TNFR1和AT1R表达的升高可能促进肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭,而AT2R表达的升高则可能具有相反的作用。3.GRK2的表达水平在HCC患者的肝脏组织中明显下降,且低表达的GRK2可增强肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭活性,提示GRK2可能是HCC形成与进展中的重要抑制因子。小鼠肝癌模型肝脏中GRK2的表达水平随着肝癌造模时间的延长而显著下降,说明GRK2可能在肝癌形成的不同时期均具有重要的抑制作用。4.TNF-α和AngⅡ在肝癌细胞中可显著降低细胞中GRK2的表达水平,且各实验组中GRK2表达水平的降低程度与其增殖、迁移与侵袭活性呈负相关,而二者在GRK2低表达的肝癌细胞中促细胞增殖、迁移与侵袭能力明显减弱,提示TNF-α和AngⅡ可能通过下调GRK2的表达促进肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭活性。5.AngⅡ对TNF-α的促肝癌细胞增殖、迁移与侵袭能力产生一定程度的抑制作用,其机制可能与联合用药后诱导细胞中GRK2和相关受体的差异性表达相关,其中GRK2和AT2R表达的升高可能抑制HCC的形成与进展,而TNFR1和AT1R表达的升高则可能产生相反的效应。