研究背景建立人妊娠的第一个关键步骤是人胚胎植入到子宫内膜上皮细胞,这一过程称为胚胎着床。人胚胎着床是一个复杂的、繁琐的过程,在此期间,胚胎首先定位,再粘附到子宫内膜层上,接着是胚胎穿透子宫内膜上皮细胞层(EEC)层入侵到子宫内膜间质细胞(ESC)层。在这一过程中,胚胎从桑葚胚发育成囊胚,子宫内膜上皮细胞分化成对胚胎具有可接受性的容受性子宫内膜,同时,囊胚的发育与子宫内膜的分化具有同步性,胚胎着床才能获得成功。哺乳动物胚胎着床过程,子宫内膜均对胚胎具有容受性,容受性期间,无粘附能力的子宫内膜上皮细胞转化成有粘附能力的子宫内膜,可以使胚胎粘附到子宫内膜上皮层,并穿透子宫内膜上皮层到间质层。容受性的子宫内膜具有以下几个特点：1)子宫内膜上皮细胞屏障的破坏,子宫内膜上皮细胞顶体膜的结构和功能的转变；2)子宫内膜上皮细胞分泌阶段特异性的蛋白质和糖蛋白；3)在子宫内膜上皮细胞分泌物的调节下,子宫内膜间质细胞发生蜕膜化改变；4)子宫内膜细胞的细胞外基质的降解和重塑。研究表明,子宫内膜上皮细胞和间质细胞的分化均受月经周期类固醇激素水平的调节,这确保了子宫内膜对胚胎的容受性在排卵后的第7-11天,这一时期称为胚胎着床的“窗口期”。可见在早期的胚胎着床中,首先是子宫内膜细胞屏障的破坏,之后发生重塑,但其重塑的机制尚不明确,细胞的迁移和分化是否跟重塑相关也不明确。上皮-间质转化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞获得成纤维细胞特性,它参与了人体许多的生理病理过程,包括胚胎发生、器官分化,组织炎症,创伤愈合等,EMT的特征是细胞的转移和侵袭,包括肿瘤细胞的早期发生和转移。同时有研究证实,在植入过程中子宫内膜上皮细胞的EMT引起的细胞迁移对容受性的子宫内膜上皮细胞的重塑起着十分重要的作用。E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白是钙粘蛋白超家族的成员,在正常的上皮细胞中表达,是一种跨膜粘附分子,能介导同种细胞的粘附,并与维持细胞的极性相关。目前众多的研究表明,在EMT中,发生了E-钙粘蛋白的下调和N-钙粘蛋白的上调,这种现象被称为“钙粘蛋白开关”。“钙粘蛋白开关”与肌动蛋白重排相关,如应力纤维的形成和皮层肌动蛋白的减弱等细胞运动加速度的控制。许多转录因子抑制E-钙粘蛋白的表达,如Snail/Slug家族蛋白、E12/E47和Twist以及ZEB家族。除了细胞粘附分子的参与,还有细胞骨架蛋白、细胞基质金属酶等均参与了EMT的发生和调控。波形蛋白(Vimentin)是一种细胞骨架蛋白,是间质细胞的标记物,在上皮细胞中不表达。波形蛋白参与维持细胞与细胞器形态、促进细胞粘附及移行及细胞凋亡相关。波形蛋白表达异常增多导致细胞骨架蛋白发生变化,使得上皮源性细胞具有间质细胞行为,更易于侵袭和转移。EMT过程中,波形蛋白的表达明显上升,在肿瘤的转移细胞中,波形蛋白过度表达,因此波形蛋白被认为是EMT的分子之一。但在胚胎植入过程中的作用尚不明确。ZEB家族属于锌指蛋白类的转录因子,包含ZEB1和ZEB2。ZEB1能与E-钙粘蛋白编码基因的启动子上的E2盒的[CACCT(G)]结合,抑制E-钙粘蛋白的转录,诱导细胞发生EMT,增强细胞的侵袭转移能力。目前研究证实ZEB1在肿瘤的发生发展及其肿瘤细胞的侵袭及转移过程中起到十分重要的作用,并与microRNA-200相互抑制,成一条负反馈途径,在肿瘤细胞中调控Notch信号途径。ZEB1在人子宫肌层和子宫间质的表达,在月经周期中的分泌期(体内雌孕激素水平高)显著高于增生期(体内雌孕激素水平较低)。在胎牛的母胚界面检测到ZEB1的高表达,在小鼠的胚胎着床过程中存在着EMT过程,同时体外细胞实验也初步证实了在胚胎着床过程,胚胎粘附到子宫内膜细胞时发生了上皮间质化过程,同时伴随了粘附因子E-钙粘蛋白的降低,以及上皮细胞标志物波形蛋白的上升和间质细胞标记物角蛋白的降低,并且胚胎着床中的间质化过程受到雌孕激素水平的调控。ZEB1和E-钙粘蛋白的E-BOX元件结合,诱导肿瘤细胞发生了上皮间质化过程而引起肿瘤细胞的浸润和转移。目前在生殖和胚胎发育过程的研究中,上皮间质化过程逐渐受到重视,但国内外的研究均较少,对其机制尚不明确。胚胎植入过程与肿瘤侵袭过程很大程度上具有相似性,而且两者都存在上皮向间质转化,而转录因子ZEB1在EMT中起着重要作用。研究表明ZEB1在人子宫肌层和子宫间质均有表达,且在分泌期的表达显著高于增生期,这一时期是胚胎植入的窗口期,因此我们推测ZEB1可能参与了胚胎植入过程的上皮间质化过程,对胚胎植入过程起着重要的作用。在去势后的δEF1/ZEB1 LacZ杂合子小鼠研究中发现,ZEB1在ER受体定位的子宫肌层和间质细胞表达且受雌孕激素的调节。根据以上胚胎植入过程的相关因子如E-钙粘蛋白、雌孕激素和ZEB1的密切关系,我们推断ZEB1参与了胚胎植入过程,其机制可能是通过下调E-钙粘蛋白促进了着床期子宫内膜细胞的EMT过程,并且该过程可能受雌孕激素的调控。目前大量的研究证实了ZEB1在肿瘤发生以及侵袭转移中的作用。而ZEB1在胚胎发育过程中作为中胚层和神经嵴细胞迁移能力标志以及在EMT中的关键作用已被证实。肿瘤的侵袭性和胚胎植入过程有很大的相似性。以往的研究结果初步说明ZEB1在胚胎植入过程中可能起了重要的作用,但目前在胚胎着床中的功能研究和机制探讨尚属于空白。临床上对复发性流产、反复胚胎移植失败、不明原因不孕症的诱因,有学说认为是胚胎着床过程失败,导致妊娠失败。因此,对胚胎着床失败的原因及其发生的机制仍亟待研究。研究目的本研究利用RNA干扰技术构建ZEB1的shRNA慢病毒载体,同时建立人体外胚胎植入体外模型和妊娠小鼠模型,旨在研究ZEB1在胚胎植入过程中的作用,并对其促进胚胎着床的EMT的机制进行初步研究,为辅助生殖及不孕不育的治疗提供新的理论依据。研究材料和方法1.利用qRT-PCR技术、免疫组织化学、Western Blot技术研究锌指转录因子ZEB1在正常人月经周期子宫内膜的表达规律。2.采用RNA干扰技术构建ZEB1的shRNA慢病毒载体,将其转染至人子宫内膜癌RL95-2细胞得到稳定的细胞株,QRT-PCR技术和Western Blot技术鉴定转染的效果。并用细胞划痕实验、EDU增殖实验和DNA复制实验对其功能进行研究。同时利用人子宫内膜癌RL95-2细胞与人绒毛膜癌JAR细胞建立人体外胚胎着床模型,研究ZEB1在人胚胎植入中的功能,并探讨在人胚胎植入过程中,ZEB1是否通过下调E-Cadherin和上调Vimentin,介导子宫内膜上皮细胞发生EMT,促进胚胎植入。3.建立妊娠小鼠模型,检测ZEB1、E-Cadherin和Vimentin在小鼠胚胎围着床期的子宫内膜的表达规律,研究ZEB1在小鼠胚胎围着床期子宫内膜引起的EMT过程。4.同时将RNA干扰后的小鼠ZEB1-shRNA稀释液注入着床前小鼠宫腔,观察小鼠的妊娠结局,初步探讨ZEB1在小鼠胚胎着床过程的作用。5.统计学方法：采用SPSS 20.0软件进行统计,计数资料用χ2检验,计量资料中,两个样本之间比较采用均值±标准差(X±S)表示,行t检验；多个样本之间比较采用方差分析,满足方差齐性的采用单因素的LSD检验,不满足方差齐性的用Welch检验,用F值表示,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果1.利用qRT-PCR技术及Western blot检测ZEB1mRNA和ZEB1蛋白的表达,结果发现ZEB1在人子宫内膜的增生早(mRNA:0.018±0.006; Protein: 1.000±0.100)、中(mRNA:0.175±0.006; Protein:0.987±0.076)、晚(mRNA:0.019±0.004; Protein:1.170±0.176)期、分泌早(mRNA: 0.022±0.007; Protein:1.357±0.832)、中(mRNA:0.043±0.015; Protein: 1.853±0.150)、晚期(mRNA:0.026±0.007; Protein:1.330±0.128)均有表达,以分泌中期的最为显著,和增生期以及分泌早期、晚期(mRNA: F=12.99, P=0.000; Protein:F=19.988, P=0.000)的比较,差异具有统计学意义。2.成功构建ZEB1-shRNA慢病毒载体,转染RL95-2细胞,得到稳定的ZEB1-shRNA-RL95-2细胞株,并对其功能进行研究。结果发现,该细胞和阴性对照细胞的ZEB1 (0.326±0.053 vs 1.001±0.138, t=-12.525, P=0.000)和Vimentin (0.498±0.117 vs 1.000±0.230, t=-4.403, P=0.000)的表达显著下调,E-Cadherin (3.260±0.342 vs 1.001±0.138, t=13.869, P=0.000)的表达显著上调。同时,72h开始,细胞的增殖能力(0.72±0.07 vs 0.94±0.09,F=4.329,P=0.003)、迁移力、DNA复制能力(43.26±5.11 vs 62.73±7.29,F=3.788,P=0.019)以及对JAR球体的粘附能力(0.398±0.065 vs 0.833±0.053,t=16.425,P=0.000)与阴性对照细胞相比也显著下降,有统计学意义。3.运用qRT-PCR和Western blot分别对未孕小鼠和孕2.5-6.5天小鼠子宫内膜ZEB1的mRNA和蛋白表达进行定量研究,结果显示妊娠小鼠子宫内膜ZEB1mRNA (mRNA:D2.5:0.028±0.007, D3.5:0.031±0.007, D4.5: 0.042±0.006, D5.5:0.031±0.008, D6.5:0.025±0.007)和蛋白(Protein: D2.5:0.032±0.005, D3.5:0.035±0.011, D4.5:0.041±0.002, D5.5: 0.029±0.012, D6.5:0.028±0.005)的表达高于非妊娠(mRNA:0.018±0.009,Protein:0.027±0.005)小鼠子宫内膜,且ZEB1 mRNA和蛋白的表达随着妊娠天数的增加呈现逐渐增加的趋势,在小鼠着床窗第4.5天达到最高,与其他妊娠组之间行两两比较,差异具有统计学意义(mRNA:F=11.165, P=0.000;蛋白：F=14.66, P=0.000)。ZEB1 mRNA和蛋白的表达从第5.5天开始下降。免疫组化染色结果显示：ZEB1蛋白在未孕和妊娠小鼠子宫内膜组织都有表达。阳性着色部位主要在细胞核,特别是上皮细胞(包括腔上皮和腺上皮细胞)胞核,妊娠小鼠基质细胞胞核也有较丰富的表达。ZEB1蛋白在小鼠子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞的阳性表达随着妊娠天数的增加呈现逐渐增强的趋势,第4.5天最为明显,直到第5.5天开始降低；而基质细胞的阳性表达在妊娠2.5天几乎未见,而在第3.5天逐渐增加,6.5天开始降低(图17)4.对小鼠子宫内膜E-Cadherin的mRNA和蛋白表达进行研究,结果显示非妊娠小鼠子宫内膜E-Cadherin的mRNA (CtrlD0:1.87±0.66)和蛋白(CtrlD0:1.000±0.251)表达高于妊娠早期小鼠子宫内膜E-Cadherin (mRNA:D2.5:1.10±0.389, D3.5:0.75±0.15, D4.5:0.30±0.13, D5.5: 0.39±0.11, D6.5:0.80±0.22) (Protein:D2.5:0.633±0.119, D3.5: 0.553±0.058, D4.5:0.213±0.029, D5.5:0.517±0.086, D6.5:0.520±0.026)的表达,且随着妊娠天数的增加呈现逐渐降低的趋势,在小鼠着床窗口期第4.5天的表达降到最低,与妊娠各组之间E-Cadherin的mRNA和蛋白的表达两两比较,差异有统计学意义(mRNA:F=26.379, P=0.000:蛋白：F=32.188, P=0.001)。E-Cadherin的表达从第6.5天开始上升。E-Cadherin在内膜上皮细胞的阳性着色部位主要在细胞浆,尤其妊娠上皮细胞(包括腔上皮和腺上皮细胞)胞浆,小鼠基质细胞的胞浆几乎未见染色,且随着妊娠天数的增加呈现逐渐减弱的趋势,在第4.5天最为明显。5.对小鼠宫内膜Vimentin的mRNA和蛋白表达进行研究,结果显示非妊娠小鼠子宫内膜Vimentin的mRNA (CtrlD0:0.59±0.21)和蛋白(CtrlD0: 0.99±0.40)表达低于妊娠早期小鼠子宫内膜(mRNA:D2.5:1.19±0.15, D3.5:1.59±0.40, D4.5:2.92±0.99, D5.5:2.13±0.51, D6.5:1.82±0.59)(Protein:D2.5:1.23±0.24, D3.5:1.64±0.26, D4.5:2.37±0.20, D5.5: 1.67±0.11, D6.5:1.52±0.31) Vimentin的表达,且随着妊娠天数的增加呈现逐渐增加的趋势,在小鼠着床窗口期第4.5天达高峰,且与妊娠各组之间Vimentin的mRNA和蛋白的表达比较差异有统计学意义(mRNA:F=23.914,P=0.000；蛋白：F=9.191,P=0.001),Vimentin的表达第5.5天的表达开始显著下降。6.在小鼠胚胎着床前的1天,经小鼠的宫角注射ZEB1-shRNA稀释液或ZEB1-shCtrl阴性对照,继续饲养至妊娠第8天,脱颈椎法处死小鼠,观察ZEB1-shRNA对小鼠胚胎着床的数量的影响。结果显示：发现ZEB1-shRNA组小鼠的胚胎着床的数量明显少于生理盐水侧子宫,差异有统计学意义(1.875±0.835 vs 7.375±1.408, t=9.505, P=0.000); ZEB1-shCtrl组小鼠的胚胎着床的数量与生理盐水侧子宫无差别,差异无统计学意义(6.375±1.119 vs7.500±1.119,t=1.888,P=0.080)。结论1.ZEB1在月经周期的子宫内膜有表达,而且分泌中期的表达显著增高,分泌中期是胚胎植入的窗口期,ZEB1在人胚胎着床窗口期的高表达,提示ZEB1可能参与了子宫内膜容受性的调节,对人早期胚胎着床起了重要的作用。2.ZEB1基因的敲除明显抑制子宫内膜RL95-2细胞的增殖和迁移,对模型胚胎JAR球体的粘附率显著下降,同时E-钙粘蛋白表达增加,波形蛋白表达减少,提示ZEB1在人胚胎植入过程中,可能是通过下调E-Cadherin和上调Vimentin,促进了胚胎植入过程中的EMT过程,引起了子宫内膜上皮细胞向间质细胞的转化,增加细胞的迁移能力。上皮细胞的迁移使上皮细胞屏障被破坏,改变了子宫内膜容受性,促进胚胎的粘附和植入。3.EMT的标记因子ZEB1和Vimentin在着床窗口期小鼠子宫内膜的高表达、E-Cadherin的低表达均提示了小鼠胚胎植入过程中也发生了EMT过程。ZEB1可能也是通过下调E-Cadherin,触发钙粘蛋白开关,上调波形蛋白,抑制粘附分子的表达,诱发了EMT的发生,引起细胞骨架的改变和应力纤维的改变,促进子宫内膜上皮容受性的改变,使着床部位的上皮屏障发生破坏和重塑,促进了胚胎植入的发生和子宫内膜的蜕膜化改变。4.在着床前期的小鼠的宫角注入小鼠ZEB1-反义寡核苷酸的稀释液,显著降低了胚胎着床率,再一次证明了ZEB1在着床起着重要的调节作用,可能是促进了子宫内膜上皮细胞的EMT过程,促进了子宫内膜上皮细胞的分化和重塑。