前言：骨肉瘤是种好发于儿童及青少年的骨原发性恶性肿瘤。它常发生肺转移,且预后较差。当前,手术结合化疗是骨肉瘤治疗的主要方式。然而,令人遗憾的是手术并不能阻止远处转移。因此,化疗在骨肉瘤的治疗中占有极其重要的地位。自从上个世纪70年代末,新辅助化疗的提出及广泛实施,使非转移性骨肉瘤的预后有了很大改进,如今5年生存率可达到70%左右。但近30多年来,骨肉瘤化疗的主导药物仍是顺铂、阿霉素及大剂量的甲氨蝶呤,它们虽对骨肉瘤有着较高的有效率,但往往也存在较大的毒副反应,如耳毒性、肾毒性、骨髓抑制等。此外,骨肉瘤还容易对这些常规化疗药物产生耐药性而导致化疗失败。因此,寻找新的有效的化疗药物对骨肉瘤治疗将有着重大的意义。氯化两面针碱(nitidine chloride, NC)是从芸香科花椒属植物两面针Zanthoxylum nitidum的干燥根中提取的一种苯菲啶类生物碱。两面针作为一种传统中药材,在我国的西南部地区有着广泛分布,其提取物主要用来抗炎、阵痛、解痉等。氯化两面针碱作为两面针的主要活性成分,近年来,有研究报道它具有一定的抗肿瘤活性。在一些体外实验中,它可明显抑制人肺癌细胞、人舌癌细胞、人口腔鳞癌细胞等。然而,其对骨肉瘤细胞的作用尚未见报道。本研究,以人骨肉瘤细胞株MG-63为对象,来探讨氯化两面针碱对其增殖抑制作用及其相关机制。目的：观察氯化两面针碱对人骨肉瘤MG-63细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用,并进一步探讨其抗骨肉瘤作用的相关分子机制。方法：采用MTT法于体外观察不同浓度的氯化两面针碱(0、0.25、0.5、1、2、4、8μmol/L)作用于人骨肉瘤MG-63细胞24、48、72小时后,其对细胞的生长抑制作用,并计算各时间点相应的半数有效抑制浓度(IC50值)。在普通倒置相差光镜下、荧光显微镜下及透射电镜下观察不同浓度的氯化两面针碱对MG-63细胞形态的影响及诱导凋亡的作用；使用Annexin V-FITC/PI双染法流式检测不同浓度的氯化两面针碱作用于MG-63细胞48小时后各自的凋亡率；并采用流式细胞术分析不同浓度的氯化两面针碱处理MG-63细胞48小时后细胞周期的分布；通过Western Blot法检测不同浓度的氯化两面针碱作用于MG-63细胞48小时后,其细胞内caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2、cdc2、cdc25c、cyclin B1和survivin蛋白的表达差异,以探讨其可能的分子机制。统计学分析用SPSS16.0统计软件完成,计量资料数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示,组间比较采用非独立样本t检验。P<0.05表示为差异有统计学意义。P<0.01表示为差异有显著统计学意义。结果：MTT结果表明,氯化两面针碱能明显抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖,且呈现一定的剂量和时间依赖性。0.5μmol/L以上的氯化两面针碱作用于MG-63细胞48小时以后,与对照组(0μmol/L)相比,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。氯化两面针碱作用于MG-63细胞24、48、72小时的IC50值分别为8.29、2.80和1.34μmol/L。普通光镜下,可发现随着氯化两面针碱浓度的增高,MG-63细胞的生长密度逐渐降低,漂浮脱落的细胞逐渐增多。经Hoechst 33258染色后,于荧光显微镜下观察,可发现对照组细胞核呈现隐约的浅绿色荧光,并大小均匀一致。而随着氯化两面针碱浓度的增高,凋亡的细胞逐渐增多,表现为细胞核大小不一,显色较为清亮,有的细胞核发生碎裂,裂解成几个浓缩的极亮的蓝色荧光颗粒等。此外,透射电镜下,经氯化两面针碱处理过的MG-63细胞仍可看到不同程度的凋亡特征,表现为细胞核染色质浓缩、边集,胞质内有大量空泡,细胞表面微绒毛减少等。Annexin V-FITC/PI双染法流式检测结果表明,氯化两面针碱可诱导MG-63细胞凋亡,其凋亡率呈明显的浓度依赖性。0、0.5、1、2μmol/L的氯化两面针碱处理MG-63细胞48小时后相应的早期凋亡率分别为2.82%、8.37%、23.75%、49.96%。细胞周期检测结果显示,氯化两面针碱能使MG-63细胞发生明显的G2/M期阻滞,随着药物浓度的增高,绝大多数的肿瘤细胞处在G2/M期,同时,处在S期的肿瘤细胞逐渐减少。Western Blot结果表明,随氯化两面针碱浓度的增高,MG-63细胞中Bax的表达依次增高,Bcl-2、cdc2、cdc25c、cyclin B1和survivin的表达依次降低,并且激活状态的cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3蛋白表达也逐渐增高。结论：氯化两面针碱能明显抑制人骨肉瘤细胞株MG-63细胞增殖,其抗骨肉瘤作用可能与其诱导MG-63细胞发生凋亡、阻滞肿瘤细胞周期G2/M期有关。氯化两面针碱作为新发现的抗肿瘤药物,在骨肉瘤治疗中可能蕴含广阔前景,值得进一步研究和开发。