论文部分内容阅读
葡萄灰霉病由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起,在葡萄采后贮藏期间尤为突出,是一种毁灭性病害,给葡萄产业造成重大经济损失。防治葡萄灰霉病主要以化学防治为主,结合农业栽培措施和保鲜技术等。长期使用化学农药,使葡萄灰霉病菌抗药性增强,并易污染果品和生态环境,给人畜健康带来危害。因此,寻求一条对采后葡萄灰霉病安全有效的防治措施成为葡萄产业发展中迫切的需求。本研究旨在从自然界中筛选获取对采后葡萄灰霉病防治有效的酵母菌株,并对其抑菌机制进行探究,以期为采后葡萄灰霉病的生物防治提供依据。目的:通过筛选获得对葡萄灰霉病具有抑制作用的拮抗酵母菌,并确定其分类地位;明确酵母菌0939-5产挥发性抑菌物质的最佳培养条件;测定挥发性物质成分,初步检测酵母菌0939-5产生的主要挥发性成分对灰葡萄孢菌的抑制作用;揭示酵母菌0939-5对灰葡萄孢菌的主要抑菌作用机理。方法:通过采用平板隔离对峙法和活体接种法对供试的334株酵母菌进行体外和体内的筛选,获得对葡萄灰霉病菌具有显著抑菌作用的拮抗酵母菌;通过形态特征、理化特性及分子生物学对筛选得到的酵母菌0939-5进行分类鉴定;采用双皿对扣法测定不同环境条件及不同营养物质对拮抗酵母产生挥发性物质的影响;添加活性炭,经平板隔离对峙法和双皿对扣法测定其对产生的挥发性物质的影响以及挥发性物质对灰葡萄孢菌菌丝生长和孢子萌发所造成的影响;通过顶空固相微萃取和气质（GC-MS）联用仪分析酵母菌产生的挥发性物质成分。结果:1)从334株酵母菌中筛选获得1株产挥发性物质的对葡萄灰霉病菌具有显著抑菌作用的拮抗酵母菌菌株0939-5,并将其鉴定为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。2)菌株0939-5在YPD培养基上产生的挥发性物质对灰霉病菌的抑制作用最好,抑制率为64.49%,以蔗糖为碳源、硫酸铵为氮源的MCDA培养基,pH值为7、温度为25℃时利于酵母菌0939-5产生挥发性抑菌物质。3)酵母菌株0939-5产生的非挥发性物质不具有抑制灰霉菌生长的作用,但酵母菌可以通过竞争作用抑制灰霉菌的生长;其产生的挥发性物质对菌丝生长的抑制率为71.59%,对孢子萌发的抑制率为99.33%,并造成菌丝畸形、扭曲,分支增多。添加活性炭吸附后,产生的挥发性物质对灰霉病菌的抑菌效果明显下降。另外,酵母菌0939-5产生的挥发性物质对供试7种病原真菌也存在不同程度的抑制作用。4)通过GC-MS检测后发现,酵母菌0939-5产生的挥发性物质成分中峰面积大于0.1%的共有26种,其中,Styrene的含量最高,达到27.39%。对5种主要挥发性气体成分的纯品进行检测后发现,Styrene对灰霉菌菌丝生长的抑菌作用最好,IC50小于5μL/L;Benzocyclobutene对孢子萌发的抑制作用最好,IC50小于15μL/L。结论:通过分离筛选获得一株酵母菌0939-5对葡萄灰霉病菌具有显著抑菌作用,且对其菌丝的生长和孢子的萌发有明显抑制作用。根据形态特征、生理生化特征和分子生物学将其鉴定为异常威克汉姆酵母（W.anomalus）;YPD培养基利于W.anomalus 0939-5产生挥发性物质抑制灰霉病菌的生长;以蔗糖作为碳源,（NH4）2SO4为氮源的MCDA培养基,pH值为7,25℃培养利于酵母菌0939-5产生挥发性抑菌物质。酵母菌0939-5产生的挥发性气体物质中Styrene的含量最高,检测后发现,Styrene对灰霉菌菌丝生长的抑制作用最好;Benzocyclobutene对孢子萌发的抑制效果最好,此研究为今后利用酵母菌产生的挥发性抑菌物质防治葡萄采后灰霉病提供有利的依据。