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肉种类掺假不仅违反了食品标识法、公平交易法和消费者保护法,还有宗教因素(回教和印度教),而且肉产品中含有未知种类还可能产生食物过敏和中毒,对消费者有着潜在的危害。目前在肉制品零售市场上,肉种类掺假是一个普遍存在的现象,尤其是熟肉制品的掺假发生率更高。由于价值低,颜色和组织相似,猪肉是价格较高的牛肉的潜在的掺假资源。目前生肉鉴别方法已经比较成熟,而熟肉制品的鉴别方法比较复杂,蛋白质在加热期间会有所变化,如蛋白质变性、蛋白质的溶解度降低以及丧失抗原性,所以鉴别加工处理过的肉品种类是比较困难的。因此免疫分析法鉴定加热过的肉品种类或检测其掺假情况,必须以具有种属专一性的耐热性抗原或热稳定性肌肉蛋白质(thermostable muscle proteins,TSMPs)作为指标。据国外大量文献报道,猪骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ(Porcine skeletal muscle troponinⅠ,PsTnI)是猪肉所特有的一种蛋白质,可以作为一种耐热种类标志蛋白(thermostable species marker protein),区分于其他熟肉制品的肉种类来源。本试验运用原核表达系统获得重组猪骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ,分别制备兔抗猪慢骨骼肌亚型肌钙蛋白Ⅰ多克隆抗体和抗猪慢骨骼肌亚型肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体,为今后建立检测熟猪肉的夹心ELISA检测方法提供可靠的生物学材料,尤其是检测价值较高的牛肉制品中的掺假猪肉奠定良好的基础。本研究的主要内容包括:1.猪骨骼肌TnI-fast/slow基因的克隆与表达根据GenBank中收录的Sus scrofa troponinⅠ(TNNI2)cDNA序列(DQ091303)和Sus scrofa troponinⅠ(TNNI1)cDNA序列(AY282922)分别设计合成了引物TnI-FP1/TnI-FP2和TnI-SP1/TnI-SP2,然后提取猪骨骼肌总RNA,利用RT-PCR方法扩增到TnI-fast和TnI-slow基因并克隆到pMD18-T载体上,对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定,BLAST比对结果:同源性达99%。分别构建了TnI-fast和TnI-slow基因的原核表达质粒(pKG-TnI-fast、pKG-TnI-slow和pET-32a-TnI-fast),并在E.coli BL21(DE3)中成功获得了表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,分别出现了分子量大小为47KD、47KD和41KD的蛋白条带,与预期融合蛋白GST-TnI-FAST、GST-TnI-SLOW和HIS-TnI-SLOW的分子量大小一致。而且Western-blotting分析表明表达产物GST-TnI-FAST和GST-TnI-SLOW融合蛋白具有良好的生物学活性,为今后的研究奠定了坚实的基础。2.兔抗猪慢骨骼肌亚型肌钙蛋白Ⅰ多克隆抗体的制备与纯化将纯化的重组蛋白GST-TnI-SLOW作为免疫原,通过设计好的免疫程序,成功制备了兔抗重组蛋白GST-TnI-SLOW的高免血清。对所得高免血清分别采用饱和硫酸铵粗提和Sephadex G-200过柱纯化,最后得到了纯化的兔抗重组蛋白GST-TnI-SLOW IgG。3.抗猪慢骨骼肌亚型肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备与纯化将纯化的融合蛋白GST-TnI-SLOW免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,经过细胞融合,分别用纯化好的GST和HIS-TnI-SLOW作为筛选抗原进行双向负筛选和双向正筛选,成功获得了三株能稳定分泌抗TnI-SLOW蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞细胞株3C8,3H10,4H9。经小鼠腹腔接种获得的单抗效价均较高,3株针对HIS-TnI-SLOW的ELISA效价均在1:6.4×10~5以上,通过辛酸硫酸铵法提纯获得了纯度较高的单克隆抗体。采用夹心ELISA方法来验证抗猪慢骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ(Porcine SkeletalTnI-SLOW McAb)单克隆抗体的特异性。实验结果表明夹心ELISA对100℃,30min处理过的猪肉样本显示阳性,而与其它动物肌肉样品没有明显的交叉反应性。证明本试验研制的针对猪慢骨骼肌亚型肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体和多克隆抗体具有动物种属特异性。