背景与目的：抗中性粒细胞胞浆抗体(antineutrophil cytoplasmic autoantibody, ANCA)相关性血管炎(ANCA-associated vasculitis, AAV)是一种自身免疫性炎症性小血管炎，在我国并不少见，尤其是在老年人中，随着ANCA检测的普及，发病率有逐年上升。该病临床表现复杂常伴多器官受累，肾脏是最常累及的器官，其病情进展凶险，可导致迅速不可逆的肾功能衰竭。迫切需要更进一步地研究AAV的发病机制，以便提出更有效的治疗策略。正五聚素-3(Pentraxin3, PTX3)是与C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)同为正五聚素蛋白家族的急性期反应蛋白，是体内一种可溶性模式识别受体(Patternrecognition receptors, PRR)，已被证实参与了许多自身免疫性疾病，并与疾病的活动性及局部组织炎症相关。中性粒细胞胞外捕网(Neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒细胞一种新发现的独特的死亡方式，通过释放出自身DNA及大量自身抗原及相关颗粒酶。NETs成分中可能含有PTX3，共同参与炎症及自身免疫。新近研究提示，PTX3可中和外来病原体，以一种天然抗体的形式保护机体。ANCA作为一种特异性生物学标志，不仅用于AAV的诊断，也与疾病活动性相关，同时ANCA本身也具有致病性，直接参与疾病的进展，形成AAV自身免疫性炎症的恶性循环。我们前期研究发现：ANCA可诱导中性粒细胞NETs形成释放自身DNA及ANCA抗原，暴露内源性危险信号。AAV患者体内血清及局部肾组织高表达PTX3，并与CRP，ESR相比，可能更能迅速反映局部组织的炎症状态及损伤[1]，有望成为新的急性期反应蛋白，更能及时反映疾病的活动性。本课题拟通过(1)检测AAV患者血清PTX3水平及肾组织PTX3的表达，结合临床病例进行BVAS评分，分析血清PTX3表达与临床血清学指标及尿蛋白的关系，以探讨PTX3在AAV发病中的意义。(2)体外分离纯化健康人及AAV患者外周血中性粒细胞，ANCA诱导健康人中性粒细胞并探测PTX3的表达，探讨PTX3在中性粒细胞的释放机制，为进一步研究PTX3在AVV发病中的作用奠定基础。方法：第一部分AAV患者肾组织及血清正五聚素-3的表达及意义1.免疫荧光染色及激光共聚焦法检测活动期AAV患者肾组织活检标本中PTX3的表达，了解活动期患者局部肾脏炎症部位是否存在丰富的PTX3。2.临床上收集AAV患者和健康人外周静脉血标本，采用ELISA方法检测血清PTX3及CRP水平，了解患者体内PTX3及CRP水平与健康对照组的差异；3.回顾性分析患者临床病历资料，用BVAS评分，评估活动期及缓解期AAV患者。独立样本非配对t检验，两独立样本非参数的曼-惠特尼U检验，皮尔逊相关性分析，评价活动期与缓解期患者PTX3表达与肾功能损害的关系；受试者工作特征性曲线评价PTX3及CRP区分疾病活动期、缓解期的准确度；第二部分ANCA诱导中性粒细胞正五聚素-3的释放机制1.采用PolymorphprepTM密度梯度离心法，分离患者及健康志愿者外周静脉血中性粒细胞，用CD16抗体标记，流式细胞术进行分析，鉴定纯度；台盘蓝染色法分别计算各组细胞平均存活率；2.ELISA方法检测各组中性粒细胞培养上清PTX3水平3.正常中性粒细胞细胞静止状态下，以及LAMP-2抗体刺激组、TNF-α刺激组、AAV患者血清刺激组及健康人血清刺激组刺激180min后，免疫荧光染色观察中性粒细胞的PTX3的释放情况。结果：第一部分1.活动期AAV患者(n=3)肾局部炎症组织中高表达PTX3，而系膜增生及IgA肾病患者肾组织仅有少量PTX3表达。2.活动期AAV患者(n=21)血清PTX3水平比缓解期患者(n=11)明显升高(P <0.0001)，也显著高于健康对照组(n=38)(P=0.03)和SLE组(P<0.01)。而SLE患者(n=8)血清PTX3水平却降低，且与健康对照组相比具有显著性差异(P <0.001)3.活动期AAV患者血清CRP和ESR水平均显著高于缓解期(P<0.05)。而低PTX3水平的SLE患者组与健康对照组相比，CRP和ESR水平均升高(P>0.05)。4. AAV患者的PTX3水平与24h尿蛋白定量呈正相关(r＝0.4329，P＝0.0169)；与白细胞计数，中性粒细胞绝对值，淋巴细胞绝对值，补体C3，血肌酐及eGFR均无明显相关性(r=0.0819，-0.1486，0.2474，0.0691，-0.1495，0.1790，均P>0.05)。血清CRP，ESR水平均与24h尿蛋白定量无明显相关性(r=-0.0993，P=0.5887；r=0.1262，P=0.4912)；PTX3与CRP水平均与BVAS呈正相关(r=0.3807，P=0.0316；r=0.3712, P=0.0365)，而ESR却与BVAS无相关性(r=0.2926，P=0.1041)。5. ROC曲线提示血清PTX3水平区分活动期与缓解期AAV的准确度高于CRP及ESR； PTX3曲线下面积为0.9567，P<0.0001；CRP曲线下面积为0.7792，P=0.0105；ESR曲线下面积为0.7424，P=0.0263。以0.721ng/mL作为区分截取值时，敏感度和特异度分别是90.48%和100%。第二部分6.免疫荧光显示PTX3储存在正常静止状态的中性粒细胞中，AAV患者外周血中性粒细胞(n=3)释放大量PTX3，较健康对照组(n=9)明显升高(P=0.0402)7.LAMP-2抗体及AAV患者血清均能刺激中性粒细胞中PTX3的释放。LAMP-2抗体刺激组上清PTX3水平与正常中性粒细胞对照组相比，明显升高(P=0.0020)；与健康人血清刺激对照组相比，AAV患者血清刺激组上清PTX3的平均荧光强度(MFI)明显升高(P=0.0029)。8.激光共聚焦显微镜显示：PTX3随自身抗原MPO及DNA一起，由中性粒细胞通过NETs方式释放出胞外。结论：1.活动期AAV患者肾脏局部组织存在PTX3高表达，且血清PTX3水平明显升高，其水平与疾病活动性及24h尿蛋白总量呈正相关，可能成为一种新的AAV活动性的急性反应蛋白。2. AAV患者中性粒细胞释放出大量PTX3，正常中性粒细胞可由ANCA诱导释放，以NETs方式，随MPO一起释放出胞外，参与AAV的病理生理过程。