背景：强直性脊柱炎(AS)是以中轴关节疼痛、僵直为主要症状的慢性自身免疫性疾病,多发于青壮年男性,致残率高。骨破坏是其主要的病理特征之一,且是病理转折的关键环节,髋关节等外周关节破坏也是造成AS患者生活质量急剧下降的主要原因之一,因此防治AS骨破坏意义重大,但目前尚无有效防治方法。研究表明,破骨细胞是骨破坏的主要参与者,单核-巨噬细胞是其前体细胞。RANKL通过激活单核-巨噬细胞中RANKL/RANK信号通路,诱导其向破骨细胞分化,因此抑制该信号通路就有可能达到防治骨破坏的目的。前期临床研究表明,以补肾活血立法的补肾强脊汤在治疗AS方面具有明显的抗炎镇痛作用,疗效确切。在前一个国家自然基金课题(30472277)中,我们探索了补肾活血含药血清抗AS骨化的分子机制,积累了一定的理论和实验基础,为后续研究顺利进行提供了重要保障。因此,本研究将借助国家自然基金课题(81173446)的支持,继续从临床以及实验的角度探索补肾活血法能否抑制AS骨破坏。目的：运用补肾强脊汤治疗肾虚血瘀证AS患者,观察治疗前后患者血清中RANKL、OPG的表达情况；运用补肾强脊汤含药血清干预AS患者髋关节滑膜中单核-巨噬细胞(破骨前体细胞),观察干预前后破骨前体细胞中RANKL/RANK信号通路的活化情况。探索补肾强脊汤对AS骨破坏的防治作用及分子机制。方法：1临床研究：设计前瞻性、开放性、治疗前后自身对照性临床研究,纳入中医辨证属于肾虚血瘀证型的活动期AS患者60例,纳入30例健康志愿者作为对照组。AS组经治疗12周,选取0、4、12周三个评价点,记录各项体征及化验指标,运用ASAS20、 BASDAI50、中医证候积分评价补肾强脊汤的疗效,并评价中药的安全性,运用ELISA检测治疗前后AS患者及正常对照组血清中RANKL、OPG的表达情况。2实验研究：以体外培养的滑膜中单核-巨噬细胞作为研究对象。滑膜组织来自5例AS患者以及5例正常对照组。AS组滑膜来自行全髋关节置换术的AS患者,正常对照组滑膜来自因股骨颈骨折须行髋关节置换的患者(排除自身免疫性疾病),滑膜均为手术废弃物,且滑膜获得符合伦理要求。运用免疫组化二步法检测组织中相关蛋白表达情况,运用酶消化法及贴壁粘附培养分离滑膜组织中单核-巨噬细胞(破骨前体细胞),运用流式细胞术鉴定细胞,运用MTT法检测细胞生长情况,制备补肾强脊汤含药血清干预细胞,运用Western blot及RT-PCR检测干预前后细胞中RANKL/RANK信号通路各级信号分子蛋白以及mRNA表达情况。结果：1临床研究：第一部分,纳入的60例活动期AS患者以及30健康志愿者作为对照,对比血清RANKL、OPG的表达情况发现,AS组RANKL、OPG的水平较正常组明显升高,P<0.05,统计学差异明显。RANKL/OPG的比值与正常组无明显差异,P>0.05。经相关性检验发现,RANKL、OPG的表达与CRP、ESR无显著相关(P>0.05),与临床观测指标(BASDAI、BASDAI、BASMI、PGA、HAQ)评分无明显相关性(P>0.05),与临床测量指标(BASMI五项)亦没有明显的相关性。第二部分,纳入的60例患者均属于肾虚血瘀证,运用中药补肾强脊汤为基础加减治疗12周,分别在入组时、治疗4周、治疗12周进行评价,评价中药的临床疗效、安全性以及其对RANKL、OPG表达的影响。其结果为,治疗4周、12周后,ASAS20达标率达为33.33%和72.55%,BASDAI50达标率分别为11.67%和39.22%,中医证候积分临床有效率分别为45.10%和79.43%,上述指标都呈逐渐上升趋势,且未发生与中药有关的不良事件；脊柱炎症、背痛评分、髋痛评分、夜间疼痛评分、肌腱端指数、脊柱活动度(颈椎前屈后伸、旋转,腰椎侧弯、前屈后伸)、髋关节活动(踝间距)、CRP、RANKL、OPG等,在治疗4周、12周后均有明显改善,P均小于0.05。RANKL/OPG的比值在治疗前后无显著统计学意义。2实验研究：第一部分,成功分离单核-巨噬细胞,经流逝细胞术鉴定,培养细胞中单核-巨噬细胞比例为55.3±4.2%。免疫组化结果显示,AS组滑膜中RANK、TRAP、CATK平均光密度值较正常对照组明显增多,P<0.05,差异有统计学意义。经Western blot检测,AS单核-巨噬细胞表面大量表达RANKL的受体RANK,且TRAF6、NF-κB、JNK、ERK、 p38、NFATc1等高表达,磷酸化的NF-κB、JNK、E(?) RK也较正常组显著升高,AS单核-巨噬细胞中破骨细胞标志蛋白TRAP及参与骨吸收的蛋白CATK、MMP3的表达均较正常组升高,以上P<0.05,差异均有统计学意义。经RT-PCR证实,AS患者滑膜中RANK、TRAP基因表达明显升高,与正常组比较,差异显著,P<0.05。第二部分,运用补肾强脊汤含药血清干预细胞后,补肾强脊汤含药血清大、中、小剂量组的RANK、TRAF6、 NF-κB、JNK、ERK、p38、NFATc1,磷酸化的NF-κB等较AS组显著降低,破骨细胞标志蛋白TRAP及参与骨吸收的蛋白CATK、MMP3也较AS组显著降低,P<0.05,尤其以补肾强脊汤含药血清大、中剂量组最为明显。结论：1,活动期AS患者血清RANKL、OPG表达升高,RANKL/OPG比值较正常组无明显改变,提示活动期AS患者骨破坏、骨形成的可能性较大,但骨破坏的发生与微环境中两者的分布有关；2,RANKL、OPG以及RANKL/OPG比值尚不能宏观地反映AS病情进展的变化,临床研究应同时纳入影像学指标来发掘其意义；3,RANKL、OPG表达与炎症出现分离现象,表明骨破坏的发生不一定是炎症引起；4,补肾强脊汤控制AS病情疗效确切,安全性高；5,补肾强脊汤可能通过多靶点、多角度防治AS骨破坏,其可能的机制是：一,通过补肾、活血,改善炎症,消除诸多炎症因子对RANKL、OPG表达的影响,下调R ANKL、OPG的表达；二,直接作用于破骨前体细胞,抑制细胞中RANKL/RANK信号通路的活化,减少破骨细胞的形成,最终达到防治骨破坏的目的。