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目的观察microRNA-142-5p(miRNA-142-5p)在大鼠角膜新生血管中(corneal neovascularization,CorNV)的作用,初步探讨miRNA-142-5p对角膜新生血管的调控机制。方法基于课题组前期的研究,选取miRNA-142-5p作为研究对象,实验主要分五部分:实验一选用雌性SD大鼠,角膜缝线法诱导其右眼CorNV作为实验组,左眼作为对照组。取缝线后第4、7、14、21d的角膜进行实时荧光定量聚合酶反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)检测miRNA-142-5p以及VEGF mRNA,免疫组化染色(Immunohistochemistry,IHC)观察VEGF在蛋白水平的变化,观察二者之间有无相关性。实验二采用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)作为研究角膜新生血管的细胞模型,Lipo-2000(LipofectamineTM-2000)将miRNA-142-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及各自的无关序列(Scramble)转染HUVECs,qPCR检测miRNA-142-5p的表达量来验证转染是否成功。分别用CCK-8、细胞划痕实验、Transwell及Matrigel胶管腔形成实验检测mi RNA-142-5p对HUVECs增殖、迁徙、侵袭及管腔形成能力的影响。实验三q PCR和蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测转染后HUVECs中VEGF mRNA和蛋白的表达量。ELISA法检测培养基中VEGF的表达量。实验四qPCR和WB检测转染后HUVECs中VEGFR2/PI3K/Akt mRNA和蛋白的表达量。实验五结膜下注射antagomir-142-5p抑制mi RNA-142-5p的表达,裂隙灯显微镜观察大鼠角膜新生血管生长的影响。利用IHC观察CD31的表达。结果实验一角膜缝线法成功建立SD大鼠CorNV模型。qPCR显示正常角膜中存在少量miRNA-142-5p和VEGF表达,角膜缝线后第4 d时miR-142-5p表达量较高,第14 d时持续升高(P<0.001),后逐渐下降,在21 d时达到4 d时的水平。同时,q PCR显示角膜缝合后4?14 d VEGF明显升高(P<0.01),21d恢复至基线水平。免疫组织化学染色(IHC)进一步证实VEGF在4至14 d明显上调,在14天时达到峰值(P<0.001)。将二者进行线性相关分析揭示miR-142-5p表达与VEGF mRNA和蛋白质水平相关性高(P<0.001)。实验二q PCR测定转染24 h后HUVECs中mi RNA-142-5p的表达水平,表明miRNA-142-5p mimic、inhibitor成功转染到培养的HUVECs中。结果显示miRNA-142-5p mimic的表达比Scramble组显着增加(P<0.001),而miRNA-142-5p inhibitor的表达与Scramble组相比显着降低(P<0.05)。与Scramble组相比,miRNA-142-5pmimic在转染24 h后明显增强HUVECs的细胞活力(P<0.001)。另一方面,miRNA-142-5p抑制剂在转染24 h后降低HUVECs的细胞活力(P<0.001)。通过细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验及Matrigel胶成管实验显示:miRNA-142-5p mimic转染48 h后显著增强了HUVECs的细胞迁移,侵袭和管腔道形成(P<0.01)。相反,与Scramble组相比,mi RNA-142-5p inhibitor降低了HUVECs的细胞迁移,侵袭和管腔形成(P<0.01)。实验三qPCR和WB结果表明mi RNA-142-5p mimic与Scramble组相比,上调HUVECs中VEGF mRNA和蛋白的表达量。通过ELISA我们还发现在用miRNA-142-5p mimic转染48小时的HUVECs培养基中VEGF蛋白表达量显著增加(P<0.001)。相比之下,与Scramble组相比,miRNA-142-5p inhibitor下调HUVECs中VEGF mRNA和蛋白的表达量(P<0.05)。实验四qPCR和WB结果表明mi RNA-142-5p mimic与Scramble组相比,上调HUVECs中VEGFR2/PI3K/Akt mRNA和蛋白的表达(P<0.001)。同时上调磷酸化Akt的表达水平。相比之下,与Scramble组相比,miRNA-142-5p inhibitor下调HUVECs中VEGFR2/PI3K/Akt的mRNA和蛋白的表达,磷酸化Akt的水平也降低(P<0.05)。实验五在缝合后的第2d和7 d,antagomir-142-5p(5 nmol)注射后大鼠角膜新生血管的面积和数量与antagomir-142-5p NC和生理盐水组显著降低(P<0.001),免疫组化显示antagomir-142-5p(5 nmol)注射后在第7d和14 d的CD31的表达与生理盐水组和antagomir-142-5p NC(5 nmol)相比显著降低(P<0.001)。结论大鼠角膜新生血管中miRNA-142-5p显著升高,且miRNA-142-5p的上调与VEGF和VEGFR2/PI3K/Akt表达的上调以及角膜新血管形成有关。Antagomir-142-5p递送可能是治疗或预防由角膜新血管形成引起的视力丧失的潜在方式。