利用RNA干扰技术抑制洋桔梗ACC合酶基因表达的研究

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洋桔梗(Eustoma grandiflorum),又名草原龙胆,为龙胆科草原龙胆属观赏植物,是目前国际上十分流行的盆花和切花种类之一,具有较高的经济价值和观赏价值。花卉的观赏寿命,特别是切花的瓶插寿命是直接影响花卉商品价值的一个极其重要的品质特征。如何使花卉延缓衰老,延长保鲜期,一直是国内外相关方面关注的重要问题。本研究以洋桔梗’Double Mariachi Pink’品种为试验材料,在洋桔梗高频再生体系和高效稳定的遗传转化体系建立的基础上,通过农杆菌介导的叶盘转化法将重组子pCAMBIA1301-gfp-(GUS+ACS)i-NPTⅡ转入洋桔梗基因组中,以期培育出瓶插寿命更长的洋桔梗新种质。叶盘转化法条件为:经预培养3d的洋桔梗叶片,用农杆菌重悬液(浓度为OD600≈0.5)浸泡10min,再于24℃黑暗条件下共培养5d,然后转入筛选培养基中选择培养抗性苗。对抗性再生植株进行了分子生物学鉴定。65株再生抗性苗经选择生根培养有46株生根,生根率为70.6%;46株健康的生根植株,对其进行PCR鉴定,得到11个PCR阳性株系;11个PCR阳性株系经RT-PCR鉴定得到3株阳性植株;对3株阳性植株进行GFP荧光观察,其中2株GFP荧光观察呈阳性;并提取该3株转基因洋桔梗的蛋白质,利用SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳法检测出gfp基因在3株RT-PCR呈阳性的洋桔梗植株中得到表达。本实验还对洋桔梗组培苗出瓶、炼苗、移栽、花期进行研究,探究组培苗根的条数对成活率的影响。结果显示,根数小于6条的组培苗,出瓶后的适应能力较差。根数目为6条以上的组培苗,根生长能力较强,有利于驯化成活。花期统计结果表明,空白洋桔梗的花期为10d,转化反义ACS基因的洋桔梗平均花期为24d,转化干扰ACSi基因的洋桔梗的花期为27d。转化干扰ACSi基因的洋桔梗花期比空白组显著延长17d,延长了洋桔梗植株的观赏周期。
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