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目的：利用流体动力学法构建小鼠乙型肝炎病毒感染模型，将能在体内转录产生发夹状小干扰RNA(siRNA)的表达载体pSIHBV/X、pSIHBV/P与pHBV1.3尾静脉共注射Balb/c小鼠，观察pSIHBV/X和pSIHBV/P在体内对HBV的抑制作用。
方法：分别提取pHBV1.3、pSIHBV/X、pSIHBV/P和pSIGFP质粒，用蛋白核酸定量仪定量。建立各组动物模型：将Balb/c小鼠随机分为6组，每组6只。A组为感染组，注射pHBV1.3(20 μg)；B组为pSIHBV/X干扰组，共注射pSIHBV/X(7.5 μg)和pHBV1.3(20μg)；C组为pSIHBV/P干扰组，共注射pSIHBV/P(7.5 μg)和pHBV1.3(20μg)；D组为pSIHBV/X+pSIHBV/P联合干扰组，共注射pSIHBV/X(7.5μg)、pSIHBV/P(7.5 μg)和pHBV1.3(20μg)；E组为无关干扰组，共注射pSIGFP(7.5μg)和pHBV1.3(20 μg)；F组为空白对照组，仅注射0.9％NS 2 ml。A～E各组质粒均用0.9％NS稀释，总量为2 ml。用45 mm头皮注射针经小鼠尾静脉6 s内注射完毕。注射后第6天，摘除小鼠眼球取血，分离血清，处死小鼠，切取数个约30 mg的肝组织块立即冻存于液氮中备用，切取5 mm×6 mm大小的肝组织块，4％甲醛固定，制作成石蜡切片。用酶联免疫分析法(ELISA)诊断试剂盒检测小鼠血清中HBsAg的含量，结果用样品吸光度(OD)值/阴性对照平均．OD值(S/N值，S表示待测样品，N表示阴性对照)表示，HBsAg S/N值≥2.1为阳性。用荧光定量PCR(FQ-PCR)检测血清HBV DNA的含量，并计算出其拷贝数的log值。用免疫组织化学方法检测肝内HBsAg、HBcAg的表达，每只小鼠取四张肝组织切片，每张切片观察5个400倍视野，每个视野计数100个细胞中的HBsAg和HBcAg阳性细胞数，取其平均值。设计针对HBV 3.5 kb mRNA、S-mRNA及0.7 kb mRNA基因区及内部参照β-肌动蛋白基因的引物并交由生物公司合成，提取肝组织总RNA，用RT-PCR法半定量检测肝内HBV 3.5 kb mRNA、S-mRNA及0.7 kbmRNA的水平，用比较阈值法计算出每个标本目的基因的相对表达量(2-△△Ct)。所有数据均以-x±s表示，由sPss 13.0统计软件处理，采用完全随机设计的多组问方差分析得出P值。P<0.05为差异有显著性。
结果：ELISA结果显示感染对照pHBV1.3组和无关干扰pSIGFP组血清HBsAg均为阳性，表达量接近；pSIHBV/X组与pSIHBV/P组较以上两组明显降低；pSIHBV/X+pSIHBV/P联合干扰组表达量更低，6R小鼠血清HBsAg均阴性。免疫组织化学检测显示pSIHBV/X组、pSIHBV/P组、联合干扰组肝HBsAg、HBcAg的表达均受到明显抑制(P<0.05)，联合干扰组的抑制作用更强。HBsAg、HBcAg阳性细胞随机分布于肝小叶中，HBsAg在感染细胞胞浆中呈弥漫性着色，而HBcAg主要位于感染细胞的细胞核内，核周胞浆也有阳性着色。FQ-PCR显示pSIHBV/X组、pSIHBV/P组、联合干扰组血清HBV DNA水平较感染组均下降(P<0.05)，联合干扰组下降更明显，抑制率分别为31％、33％、49％。RT-PCR结果显示，pSIHBV/X组、pSIHBV/P组、联合干扰组血消HBV 3.5 kb mRNA、S-mRNA的水平较感染组均明显下降(P<0.05)，联合干扰组下降更显著。pSIHBV/X组和联合干扰组HBV 0.7 kb mRNA的水平较感染组明显下降(P<0.05)，而两组间无明显差异，pSIHBV/P组HBV 0.7 kb mRNA的水平无明显下降。表明pSIHBV/X对HBV 3.5 kb mRNA、S-mRNA、 0.7 kb mRNA有明显抑制作用，而pSIHBV/P对HBV 3.5 kb mRNA、S-mRNA有明显抑制作用，对0.7 kb mRNA则无明显抑制作用。检测结果提示这两种siRNAs均能明显抑制HBV mRNA、DNA复制和蛋白表达，联合干扰作用更强，两者对HBV 3.5 kb mRNA、S-mRNA、DNA复制及蛋白表达的抑制作用无明显差异，而无关干扰pSIGFP无明显抑制HBV mRNA、DNA复制及蛋白表达的作用。
结论：本实验利用流体动力学方法成功构建了小鼠乙型肝炎病毒感染模型。该模型类似于人体自然感染HBV的过程，各种乙肝标志物表达产量均较高，方法简单易行，为今后进行药物筛选及抗病毒治疗的研究奠定了一定基础。质粒pSIHBV/X、pSIHBV/P在小鼠肝细胞中转录产生的两种siRNAs对HBV mRNA、DNA复制和蛋白表达均有显著抑制作用，两者联合治疗抑制作用更强，而无关干扰pSIGFP对HBV无明显抑制作用。