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目的检测胰腺癌组织中金属基质蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)的表达及其临床意义。构建靶向MMP-2基因的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)真核表达质粒载体,研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)对胰腺癌PANC-1细胞MMP-2基因、蛋白表达以及细胞侵袭行为的抑制作用,为将来进一步研究胰腺癌侵袭转移机制以及抗胰腺癌侵袭治疗提供基础。方法利用免疫组织化学方法检测36例胰腺癌组织和14例正常胰腺组织中MMP-2蛋白的表达情况,比较两组间的差异,从而分析MMP-2的表达与胰腺癌临床特征的关系。设计一对针对MMP-2基因的siRNA,并根据该序列合成两条小发夹RNA(small hairpin RNA, shRNA)的DNA模板单链,正义模板链两端分别设计加上两个限制性酶切位点BamHⅠ和HindⅢ。退火形成siRNA载体插入片段。用限制性内切酶将siRNA空载体线性化,T4连接酶将插入片段连接到siRNA空质粒中。经PCR和测序的方法鉴定重组质粒是否构建成功。通过阳离子脂质体Lipofectamine? 2000将重组质粒和阴性对照质粒转染至人胰腺癌细胞株PANC-1中。以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,用流式细胞仪和荧光显微镜观察质粒转染效率,G418筛选挑取阳性单克隆细胞培养8周。实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, RQ-PCR)检测MMP-2 mRNA表达变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫细胞化学法检测MMP-2基因在蛋白水平的表达变化;Transwell小室侵袭实验检测MMP-2基因被干扰后对PANC-1细胞侵袭能力的影响;MTT比色法检测PANC-1细胞增殖活性。结果(1)36例胰腺癌组织中MMP-2阳性率66.7%,正常胰腺组织中MMP-2阳性率14.3%,两者差异有统计学意义。MMP-2的阳性表达率与胰腺癌临床分期有关,但与胰腺癌的分化程度无关。(2)经PCR及测序鉴定证实靶向MMP-2基因的siRNA重组质粒构建成功。(3)经G418筛选挑取阳性单克隆细胞,重组质粒转染细胞效率最高达82.1%。(4)重组质粒转染PANC-1细胞后,MMP-2基因mRNA水平被有效地抑制,干扰效率为71.74%;MMP-2蛋白的抑制效率为49.82%。免疫细胞化学染色对照组MMP-2呈强阳性染色,而转染重组质粒的实验组MMP-2呈弱阳性染色。(5) Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力抑制率达33.0%;MTT比色法显示转染重组质粒的实验组与对照组相比,细胞的增殖活性无明显变化(P>0.05)。结论胰腺癌组织MMP-2表达增强,MMP-2的阳性表达率与胰腺癌临床分期以及淋巴结转移关系密切,而与胰腺癌的分化程度无关。体外成功构建了靶向MMP-2的siRNA真核表达质粒载体并有效转染PANC-1细胞。靶向MMP-2的siRNA表达质粒能有效抑制胰腺癌PANC-1细胞MMP-2基因mRNA及其蛋白表达,同时PANC-1细胞的体外侵袭能力明显下降。提示MMP-2基因可以作为胰腺癌抗侵袭转移治疗的靶点,RNAi有望成为肿瘤基因治疗的有效手段。