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H9N2亚型禽流感对我国养鸡业造成了巨大损失,现有多种H9亚型禽流感灭活疫苗用于临床免疫预防。免疫压力促进新出现的变异株,免疫鸡场仍可不断分离出H9亚型禽流感病毒,。因此,进一步提高H9亚型禽流感疫苗免疫效力,特别是提高疫苗的交叉保护效力十分必要。免疫增强剂是能提高疫苗免疫效力的一类生物活性物质,相关研究近年来成为国外研究热点。本文在现有油乳剂灭活疫苗的基础上,分别添加不同的免疫增强剂,分别用体外和体内实验方法,筛选获得理想的专用免疫增强剂,并对其免疫增强机理进行了初步探讨。1H9N2禽流感灭活疫苗免疫增强剂的筛选实验方法：将14日龄的SPF鸡160只,随机分成8个组,每组20只鸡。第1-6组为免疫增强剂实验组,免疫添加不同免疫增强剂的油乳剂灭活疫苗,第7组为免疫常规灭活疫苗,第8组为空白对照组。免疫后2周、第3周、第4周采血,检测血清血凝抑制抗体效价。免疫后4周,用107.0EID500.1ml/只SD01毒株滴鼻攻毒。攻毒后3、5、7天采集喉拭子和肛门拭子,接种10日龄SPF鸡胚。实验结果：在油乳剂灭活疫苗的基础上,添加免疫增强剂VA5、VA17和VA24可显著提高疫苗的免疫效力。以制苗毒株NJ/02为检测抗原,6种免疫增强剂实验组与常规疫苗组相比,血清HI抗体效价提高1-2个滴度,其中以免疫增强剂VA5和VA17最显著。以攻毒毒株SD01为检测抗原,免疫血清HI抗体效价普遍较低,说明免疫毒株和攻毒毒株抗原差异较大,免疫增强剂亦可提高血清HI抗体效价提高1-2个滴度,其中以免疫增强剂VA5、VA17和VA24最显著。攻毒3、5、7天,常规疫苗组排毒分离率分别为5/20、3/20和3/20,免疫增强剂VA5和VA24组未分离到病毒,其它免疫增强剂组排毒分离率和排毒持续时间明显下降。2鸡IFN-γ、IL-4和IL-2Real Time PCR检测方法的建立实验方法：根据GenBank中鸡ACTB、IFN-γ、IL-4和IL-2基因序列设计引物,用RT-PCR扩增鸡外周血淋巴细胞相应的基因片段,克隆至pMD19-T载体中,测序验证其序列的正确性。再设计鸡ACTB、IFN-γ、IL-4和IL-2Real-Time PCR扩增引物,以上述标准样品质粒为模板,优化Real-Time PCR反应体系中引物使用浓度和退火温度,评价Real-Time PCR反应体系。实验结果：该Real-Time PCR反应体系具有良好的扩增效率、特异性、重复性、稳定性和敏感性。其标准程序是,引物添加量为0.5u1(浓度为20pmol/ul), TaKaRa推荐的Roche LightCycler反应体系,退火温度为60℃,作用40个循环。其中,20pmol/ul引物添加量0.2-1.0u1,对扩增曲线CT值无显著影响,扩增产物有单一的熔解峰；模板浓度范围在103-108copies/ul,ACTB、IFN-γ、IL-4和IL-2的扩增效率分别为92.1%,100.2%,98.0%,103.0%,4条标准曲线的相关系数R2均大于0.99,均具有良好扩增反应。3免疫增强剂免疫增强作用研究实验方法：分离培养免疫SPF鸡的脾脏淋巴细胞,用PHA进行刺激,分别在2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h检测IFN-γ、IL-4和IL-2的表达量,以确定各细胞因子的最佳检测时间。14日龄SPF鸡分成三组,分别免疫含VA5免疫增强剂H9亚型禽流感疫苗、常规H9亚型禽流感疫苗,设立空白对照组。免疫后第1、3、5、7和10天,分离脾脏淋巴细胞用于细胞因子检测。另用MTT法检测各免疫组的淋巴细胞转化效率,并检测在免疫后第2、3和4周的HI抗体效价。实验结果：IFN-γ和IL-2的最佳检测时间均为PHA刺激后6h,IL-4的最佳检测时间为12h。与常规疫苗免疫组相比,含VA5免疫增强剂疫苗组的IFN-γ表达量在免疫后第5天达到高峰,为常规疫苗组的30倍,而后逐渐下降；IL-4表达量在免疫后第3天一直呈上升趋势,均显著高于常规疫苗组；IL-2表达量在免疫后呈上升趋势,直至第7天达到高峰,而后逐渐下降。淋巴细胞转化实验表明,在免疫后第3天、第5天、第7天和第10天,含VA5免疫增强剂疫苗免疫组均高于常规疫苗组。HI效价检测表明,在免疫后第2周、第3周和第4周,VA5免疫增强剂疫苗免疫组均高于常规疫苗组。综上所述,免疫增强剂十分显著地提高了禽流感灭活疫苗的免疫效力。其主要机制是,免疫鸡血清HI抗体,淋巴细胞IFN-γ、IL-4和IL-2表达量,以及淋巴细胞转化率均明显提高。