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棉蚜Aphis gossypii Glover(Hemiptera:Aphididae)是一种重要的世界性农业害虫,是为害棉花的主要害虫之一,在中国各个棉区都有发生。作用于昆虫烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,n ACh R)的新烟碱类杀虫剂吡虫啉广泛用于棉蚜的防治。但是随着吡虫啉使用范围的扩大和使用频率的增加,棉蚜对吡虫啉的抗性在全世界都有报道。研究表明抗吡虫啉棉蚜烟碱型乙酰胆碱受体β1亚基发生精氨酸向苏氨酸的突变(R81T)。在此基础上,本文建立竞争性等位特异性PCR技术(c PASA)和实时荧光定量等位特异性PCR技术(rt PASA)检测棉蚜n ACh Rβ1亚基R81T的突变频率,从而明确田间棉蚜种群对吡虫啉的抗性水平。1.吡虫啉对棉蚜田间种群毒力测定采用浸叶法,测定了山东德州(DZ)、北京(BJ),河南许昌(XC)、河北邯郸(HD)和廊坊(LF)五个地区棉蚜种群对吡虫啉的敏感性。结果表明,五个地区的棉蚜种群对吡虫啉敏感度不同。河南许昌(XC)和北京种群(BJ)对吡虫啉较为敏感,LC50值分别为1.03μg/m L和0.87μg/m L。河北邯郸(HD)棉蚜种群对吡虫啉也处于较敏感阶段,其LC50值为3.74μg/m L;河北廊坊种群(LF)和山东德州种群(DZ)对吡虫啉均有一定的抗性,LC50值分别为20.70μg/m L和44.90μg/m L。将北京种群(BJ)作为敏感种群,河北邯郸(HD)棉蚜种群的相对抗性倍数为4.3倍,未达到抗性水平;廊坊种群(LF)和山东德州种群(DZ)的相对抗性倍数分别为23.8倍和51.6倍,处于中高抗水平。2.棉蚜抗、感种群烟碱型乙酰胆碱受体β1亚基基因克隆以棉蚜的BJ敏感种群和DZ、LF抗性种群为实验材料,对烟碱型乙酰胆碱受体β1亚基基因片段进行克隆,并进行序列分析。结果发现,DZ、LF棉蚜抗性种群存在与吡虫啉抗性相关的精氨酸到苏氨酸(R81T)突变,BJ敏感种群不存在R81T的突变。3.竞争性等位特异性PCR技术检测棉蚜田间种群对吡虫啉抗性根据棉蚜R81T突变位点,设计了c PASA检测引物,检测LF、DZ棉蚜田间种群R81T突变频率。结果表明,田间LF种群R81T突变频率为38%,DZ种群R81T突变频率为48%。4.实时荧光定量等位特异性PCR技术建立为了建立一种更加快速、精确的检测方法,将等位特异性PCR技术与实时荧光定量PCR方法相结合,建立了实时荧光定量等位特异性PCR(rt PASA)方法。将突变纯合子(RR)与敏感纯合子(SS)以不同比例混合,利用荧光定量PCR技术得到突变频率与Ct值之间的标准曲线,当突变频率>1%时,标准曲线为y=-3.613x+20.37,R2=0.991;当突变频率<1%时,标准曲线为y=18.8+2.1/{1+10-(0.7x+0.35)},R2=0.997。通过测定样品的Ct值得到田间抗性种群的突变频率。5.实时荧光定量等位特异性PCR技术检测棉蚜田间种群对吡虫啉抗性根据已经建立的方法,测定棉蚜田间抗性种群R81T突变频率。结果表明,LF种群R81T突变频率为34.7%±1.3%,其95%置信区间为31.4-38.1%;DZ种群R81T突变频率为45.2%±5.2%,其95%置信区间为32.3-58.1%。该方法测得的棉蚜种群R81T突变频率与c PASA检测到的频率结果相匹配(LF 38%,DZ 48%),说明rt PASA方法可以检测与吡虫啉抗性有关的靶标位点突变,以实现快速、有效地监测棉蚜田间抗性。