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1研究背景和目的支气管哮喘（简称哮喘）是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分（cellular elements）参与的气道慢性炎症性疾患。这种慢性炎症导致气道高反应性的增加,通常出现广泛可变的可逆性气流受限,并引起反复发作的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状,常在夜间和（或）清晨发作、加剧,多数患者可自行缓解或经治疗缓解。哮喘是严重的全球健康问题,约有3亿人受累,全世界不同国家不同年龄的人群都被这种慢性气道紊乱困扰,若控制不良会严重限制日常活动,有时甚至是致命的。大多数国家哮喘的患病率在上升,尤其在儿童。哮喘是沉重的负担,不仅因为医疗花费,而且丧失劳动力。因此,对哮喘的研究具有重要的公共卫生及社会经济价值。对哮喘病情观察的传统方法主要是基于临床症状和肺功能检查,这些指标并未能从哮喘的本质特点慢性气道炎症进行监测。目前很多研究发现呼出气一氧化氮（exhaled nitricoxide,eNO）与气道炎症、气道高反应性具有显著相关性,eNO可以用于哮喘的诊断及呼吸道疾病的鉴别诊断。但是eNO的检测需患者保持恒定的呼气流速,且直接监测eNO的测定仪器价格昂贵,以上因素限制其在临床广泛应用。呼出气冷凝液（Exhaled breatcondensate,EBC）检测是近年来发展起来的一种无创检测呼吸道疾病炎症状态的方法,它是评价气道炎症和氧化应激程度的一种无创手段,具有简便、易行、重复性好等优点,可以适用于任何年龄和状态的病人,包括小孩和机械辅助呼吸的病人。目前,一些学者认为EBC是收集eNO的一种方法,研究EBC的NO反应产物可以间接反应NO的变化情况。本研究试图检测支气管哮喘急性发作期患者EBC中NO2-（NO反应产物之一）的含量,比较与正常对照的差异,进一步了解其是否可成为评估哮喘严重程度的指标。2研究对象和方法2.1对象2006年02月-2008年07月深圳市第六人民医院急诊及呼吸科门诊或住院患者60例,均符合中华医学会呼吸病学会分会哮喘学组2003制定的支气管哮喘防治指南的诊断标准,按急性发作期病情严重程度分级,其中轻度23例,男10例,女13例,年龄25～47岁,平均（40.0±5.0）岁;中度21例,男11例,女10例,年龄20～45岁,平均（37.7±9.6）岁;重度16例,男9例,女7例,年龄19～49岁,平均（37.6±9.1）岁。正常对照组:选取健康人23名,其中男11名,女12名,年龄18～48岁,平均（40.6±7.8）岁,各组间性别（χ2=0.720,P=0.868）和年龄（F=0.766,P=0.517）无显著差异。2.2病例排除标准年龄＜16岁或者＞50岁;孕产妇、哺乳期妇女;吸烟者,或近3个月内有规律的被动吸烟;近3天食用腌制食品;试验前四周内有呼吸系统感染病史;哮喘急性发作期患者伴有呼吸系统感染:患有哮喘以外的呼吸道慢性疾病史;有高血压、糖尿病史;试验前72小时内曾使用过糖皮质激素（吸入、口服、静脉途径）、茶碱、支气管扩张剂、白三烯调节剂、色甘酸钠。2.3方法2.3.1肺功能检测应用德国耶格公司肺功能仪,在收集EBC之后,检测呼出50%肺活量时流速（MEF50%）及FEV1占预计值百分比（FEV1%）以及其他肺功能通气指标。2.3.2 EBC收集采用美国Respiratory Research公司EBC收集装置（Rtube）。该装置由制冷铝管、保温套、收集管、推杆、盖子组成。其中收集管带有2个活瓣,经口吸气时,气流从底部活瓣进入,经口呼气时,气流从另一活瓣呼出,进入装置上部冷凝室,形成了冷凝液。收集EBC前受检者用蒸馏水漱口3次。从-10℃冰箱中取出制冷铝管,组装成EBC收集器。受检者取坐位,经口、平静潮式呼吸,收集时间为15分钟。采集过程中不断的吞咽口水,若发生咳嗽或暖气立即脱开接口,以防止唾液、胃内成分的污染。2.3.3 NO2-的测定方法通过Griess反应,NO2-与显色剂生成有色物质,分光光度法测定NO2-的吸光度,标准曲线法（配制相同基体的含有不同浓度NO2-的标准溶液,分别测其吸光度,绘制标准曲线,在同样操作条件下,测定试样溶液的吸光度,从标准曲线上查得浓度。）测出NO2-浓度。2.3.4诱导痰的收集、处理和细胞学检测所有受试对象在肺功能检查及收集EBC之后,吸入沙丁胺醇气雾剂200μg后雾化吸入3%的氯化钠溶液10 min,有痰则拭鼻涕、漱口、饮水、咳痰;无痰则用4%和5%氯化钠溶液继续雾化,直到收集到痰标本3～5 ml。若操作过程中患者症状加重不能耐受时应停止诱导痰操作并给予相应处理直至缓解。痰涂片可见较多柱状上皮细胞和巨噬细胞且鳞状上皮细胞占有核细胞的比例小于20%的标本为合格痰标本。使用钝头镊子镊取标本中的痰成分,与4倍体积的0.1%二硫苏糖醇溶液混匀后37℃孵育15 min后用48μm纱布过滤,滤出液2 000 r/min离心10 min后,用PBS（pH7.4,0.1 mmol/L）重悬细胞沉淀,2 500 r/min离心,细胞沉渣涂片。每份标本制作3张以上涂片,瑞氏染色,油镜下计数400个非鳞状细胞,计嗜酸细胞百分比（Eos%）。鳞状细胞＞20%为不合格痰标本。2.4.统计学处理运用SPSS 15.0统计软件包进行统计学处理,实验数据用（?）±s表示。计量资料用χ2检验,计数资料用Levene检验进行方差齐性检验。两组样本均数比较采用独立样本t检验;多组样本均数比较采用单因素方差分析（方差齐时）或校正的方差分析（（Welch法）,方差不齐时）检验,两两间比较用LSD-t检验（方差齐时）或Tambane’s T2检验（方差不齐时）;用Pearson进行相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。3实验结果3.1哮喘组和对照组NO2-、Eos%及MEF50%、FEV1%的比较哮喘组患者NO2-（2.33±1.12）μmol/L较正常对照组（0.59±0.25）μmol/L显著增高（t=-11.301,P=0.000）,有统计学意义;哮喘组患者诱导痰Eos%（23.43±8.47）%与正常对照组（1.36±0.37）%相比,有显著性差异（t=-20.121,P=0.000）。哮喘组患者MEF50%为（62.99±15.56）%。低于对照组（91.17±9.28）%（t=-8.128,P=0.000）,有统计学意义。哮喘组患者FEV1%为（68.55±16.85）%,低于对照组（93.40±8.49）%（t=8.862,P=0.000）,有显著性差异。3.2不同严重程度急性发作期哮喘患者EBC中NO2-及诱导痰Eos%和MEF50%、FEV1%比较在哮喘急性发作轻、中、重度组及正常对照组中EBC中NO2-的值分别为（1.42±0.25）μmol/L、（2.24±0.66）μmol/L、（3.77±0.88）μmol/L、（0.59±0.25）μmol/L,两两间比较差异均有统计学意义（F=107.794,P=0.000）;在哮喘急性发作轻、中、重度组及正常对照组中诱导痰Eos%分别为（16.36±3.00）%、（22.86±4.74）%、（34.33±5.95）%、（1.36±0.37）%,两两间比较差异均有统计学意义（F=468.143,P=0.000）;在哮喘急性发作轻、中、重度组及正常对照组中MEF50%分别为（75.48±11.20）%、（61.99±9.97）%、（46.33±10.00）%、（91.17±9.28）%,两两间比较差异均有统计学意义（F=68.712,P=0.000）;在哮喘急性发作轻、中、重度组及正常对照组中FEV1%分别为（82.70±6.52）%、（70.67±7.78）%、（45.44±9.52）%、（93.40±8.49）%,两两间比较差异均有统计学意义（F=121.638,P=0.000）;且病情越重,NO2-及Eos%值越高,MEF50%和FEV1%则越低。3.3急性发作期哮喘患者EBC中NO2-、诱导痰Eos%与肺功能指标相关性分析急性发作期哮喘患者EBC中NO2-水平和诱导痰中Eos%呈显著正相关（r=0.762,P=0.000）;NO2-与MEF50%呈显著负相关（r=-0.830,P=0.000）;NO2-与FEV1%呈负相关（r=-0.724,P=0.000）。4结论1、哮喘急性发作期不同严重程度之间（轻度、中度、重度）的呼气冷凝液NO2-的水平有显著性差异（F=68.123,P=0.000）。2、哮喘患者EBC中NO2-能作为评估急性哮喘严重程度的有效指标之一。