背景和目的泌尿道感染(urinarytractinfection,UTI)是临床上最常见的感染性疾病之一,主要由细菌自尿道逆行所致,易复发。部分重症患者可导致肾功能衰竭。有研究表明,导致泌尿道感染的病原菌近80%为大肠埃希菌。尿路致病性大肠埃希菌CFT073菌株可分泌一种含有Toll/interleukin 1 receptor结构域的蛋白(TcpC),与大肠埃希菌所致肾盂肾炎的发生发展密切相关。Toll样受体(TLR)是一类主要表达于巨噬细胞、DCs等抗原提呈细胞的模式识别受体,可识别和结合相应的病原相关分子模式,激活信号传导,介导免疫应答。TcpC可直接与MyD88结合,阻断TLR信号通路,抑制NF-κB的激活,抑制巨噬细胞的功能,改变宿主固有免疫应答功能状态,从而增强细菌的毒力,在大肠埃希菌所致肾盂肾炎中发挥重要作用。在感染性疾病中,机体通过免疫系统来识别和清除入侵的病原微生物,其过程十分复杂,包括固有免疫和适应性免疫。树突状细胞(dendriticcells,DCs)是迄今所知功能最强的专职抗原提呈细胞,在免疫应答的首要环节即抗原提呈中起重要作用。未成熟DCs具有极强的抗原摄取、处理和加工能力,而成熟DCs具有很强的抗原提呈功能,主要参与细胞免疫和T细胞依赖的体液免疫应答。同时,DCs又是固有免疫和适应性免疫的桥梁和纽带。DCs的免疫调节作用与其表面诸多受体分子(如TLRs和C型凝集素)相关。TLRs是重要的模式识别受体,在DCs分化成熟中发挥重要作用。TLR可特异性识别细菌、虫体、真菌和病毒等保守的PAMPs而捕获病原体,调控DCs成熟和细胞因子分泌,从而调节抗原提呈、T细胞的激活,影响和控制固有免疫和适应性免疫应答的强度和质量。而肾小管间质内分布大量的DCs,可通过调节固有免疫和适应性免疫应答而清除病原体,影响肾盂肾炎的发生和发展,在肾损伤和肾炎中均起重要作用。因此,研究TcpC对肾盂肾炎模型小鼠肾脏DCs分化成熟的影响,为阐明大肠埃希菌所致急性肾盂肾炎的病理生理机制提供新的实验依据。方法1肾盂肾炎小鼠模型的建立腹腔注射三澳乙醇麻药,麻醉小鼠;用弯有35。角的留置针经尿道插入膀胱,注入0.1 ml浓度为1011/ml的菌液或生理盐水,3小时后第二次注射,3天后处死模型小鼠,取肾脏用于后续分析。本实验设为3组:NS组,注入生理盐水;TcpCwt组,注入野生型CFT073菌株;TcpCdel组,注入tcpc基因敲除的CFT073菌株。2石蜡切片的制作与HE染色取材固定,冲洗,脱水,透明,浸蜡,包埋,切片,贴片,拷片。HE染色:脱蜡,细胞核染色(苏木精染色10min;自来水洗;盐酸酒精3-5 s;自来水洗),细胞质染色(伊红染色15-20 min;70%酒精;80%酒精),脱水,透明,封片。3免疫磁珠分选肾脏DCs取小鼠肾脏,剪碎,加入消化液消化25 min,过滤网,离心,加入5 ml Tris-NH4Cl,常温5-10 min,离心重悬得细胞悬液;细胞计数,加入少许Buffer(PBS+0.5%FBS+2mMEDTA)洗涤,离心,弃上清,每108个细胞用100μl Buffer重悬,每108个细胞加入100μl的CD11c+磁珠抗体体4℃孵育育2 min,每107个细胞加入1-2 ml Buffer洗涤,离心,弃上清,重悬;磁珠分选:将MACS分离磁铁安装到MACS多用支架上,并将MS分选柱放到磁铁中,润洗分选柱,将细胞悬液上样到分选柱上;用缓冲液冲洗分离柱,每次0.5 ml,洗3次;取下分选柱,用lmlBuffer洗脱柱子内的细胞,即为所要的DCs。4肾脏DCs表型变化的检测流式细胞术分析DCs表面分子CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ 及 MHC-Ⅱ 的表达。5 DC细胞培养将分选的各组肾脏DCs培养于RPMI-1640培养基(含10%FBS,100 U/ml青链霉素混合液),细胞配成5×105 cells/ml,铺于24孔板,每孔1 ml。于37℃含5%CO2的孵箱内培养48 h后收集细胞上清液。6免疫磁珠分选OT-Ⅰ和OT-Ⅱ小鼠脾脏中CD4~+T及CD8~+T细胞取小鼠脾脏用毛玻璃磨碎,过滤网,离心,加Tris-NH4Cl裂解红细胞,离心,重悬后计数,加入磁珠抗体,孵育15 min过柱,洗柱之后将MS柱撤离磁场,洗脱所要的T细胞。7 TcpC对DC抗原提呈功能的影响(1)DCs分别与大肠杆菌CFT073野生株和tcpc基因敲除株共培养收集DC2.4,洗涤后配成3×105 cells/ml铺于Transwell24孔板的下室,1 ml/孔;上室加3×106个细菌(细胞数:细菌数=1:10)。以3种方式处理:空白对照组,即DC2.4组;DC2.4+TcpCwt组;DC2.4+TcpCdel组。每组做3个复孔。孵箱中培养20h。收集细胞用于和T细胞共培养。(2)抗原肽特异性CD8~+T或CD4~+T细胞的增殖活化反应将(1)中收集的3组DCs配成浓度为l×1l5cells/ml;将分离的T细胞配成浓度为1×106cells/ml;取DCs细胞悬液100 μl和T细胞悬液100μl铺于96孔板共培养;加入终浓度为2 μg/ml的OVA257-264或OVA323-339肽;于37℃、含5%CO2的孵箱中共培养72 h,收集细胞上清,用于检测细胞因子IL-2和IFN-γ的含量。8细胞因子检测ELISA检测肾脏组织匀浆中细胞因子CXCL-2、IL-1β及IL-6的浓度,和肾脏DCs分泌的细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12及IL-23的浓度,以及T细胞分泌的细胞因子IL-2和IFN-γ的浓度。结果1 TcpC能增加肾盂肾炎模型小鼠肾脏内细菌载量,使中性粒细胞大量聚集。三组小鼠肾脏组织匀浆细菌培养结果发现,TcpCwt组肾脏内细菌量是TcpCdd组的3.5倍,而NS组中无细菌生长。肾脏组织石蜡切片HE染色后观察到TcpCwt组中有大量中性粒细胞的浸润,而TcpCdel组中中性粒细胞浸润的较少。2 TcpC能显著增加肾盂肾炎模型小鼠肾脏组织内细胞因子CXCL-2的浓度,对IL-1β的影响不显著,而对IL-6的分泌具有抑制作用。NS组中肾脏组织内细胞因子CXCL-2、IL-1-β和IL-6的含量分别为155.4±23.3(ng/ml)、17600.0±763.7(pg/ml)和 465.6±13.8(pg/ml),TcpCwt组 CXCL-2、IL-1β和 IL-6 含量分别为 327.9±20.9(ng/ml)、19016.0±503.5(pg/ml)和 616.4±26.5(pg/ml),TcpCdel组肾脏组织内细胞因子CXCL-2、IL-1-β和IL-6的含量分别为206.6±17.1(ng/ml)、20600.0±480.8(pg/ml)和 740.2±17.1(pg/ml)。结果表明,大肠埃希菌逆行至肾脏后引起了肾脏内细胞因子的分泌量增加,且TcpC能显著增加肾脏组织内趋化因子CXCL-2的含量,对IL-1-β的分泌无显著影响,而对IL-6的分泌具有抑制作用。3 TcpC抑制肾脏DCs表面分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表达。NS 组肾脏 DCs 表面分子 CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ 及 MHC-Ⅱ 的平均荧光强度(Mean fluorescence intensity,MFI)分别 为 49.94±4.80、43.99±1.90、39.43± 1.37、58.56±2.63、65.58±5.78 和 138.20±10.95,TcpCwt组肾脏 DCs 表面分子 CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ 及 MHC-Ⅱ 的平均荧光强度(MFI)分别为 26.72±4.24、39.90±3.01、33.16±2.60、51.43±3.33、67.78±4.45 和 85.88±3.34,TcpCdel 组 DCs 表面 CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ 及 MHC-Ⅱ 的 MFI 分别为 92.88±10.20、52.12±5.58、47.26±1.84、86.94±4.16、88.28±8.29 和 139.69±6.75。结果表明,肾脏DCs受细菌产物等的刺激后高表达膜表面分子,TcpC对肾脏DCs表面分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表达具有抑制作用。4 TcpC对肾脏DCs功能成熟具有抑制作用。4.1 TcpC对肾脏DCs分泌IL-1β、IL-6、IL-12及IL-23等细胞因子具有抑制作用。NS组肾脏DCs上清液中细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23的含量(pg/ml)分别是 340.5±12.0、51.3±3.5、29.0±4.2 和 67.6±12.8,TcpCwt组肾脏 DCs 上清液中细胞因子 IL-1β、IL-6、IL-12 和 IL-23 的含量(pg/ml)分别是 185.0±26.9、34.2±7.6、40.4±5.7和93.4±8.1,而TcpCdel组对应的细胞因子含量(pg/ml)分别是427.5±34.7、72.6±5.4、61.0±3.4和148.9±13.3。结果表明,肾脏DCs受细菌产物等的影响,其分泌细胞因子的能力增强,同时说明TcpC对小鼠肾脏DCs分泌IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23等细胞因子具有抑制作用。4.2 TcpC抑制DCs通过MHC-Ⅱ类分子途径提呈抗原。CD8~+T细胞分泌的细胞因子IL-2和IFN-γ的水平较低,其中TcpCwt组含量(pg/ml)分别为292.18±19.64、697.2±55.6,且各组间的差异没有统计学意义(P>0.05)。CD4~+T 细胞分泌的细胞因子 IL-2 和 IFN-γ 中,TcpCwt组(1870.0±216.5、10581.3±914.9pg/ml)均低于 TcpCdel 组(2699.4±134.1、15520.2±780.2pg/ml),且差异具有统计学意义(P<0.05),表明TcpC+的CFT073菌株处理的DCs,其通过MHCⅡ类分子途径提呈抗原的功能下降。结论TcpC对肾盂肾炎模型小鼠肾脏DCs的分化成熟具有抑制作用。