研究目的肺组织是机体唯一大面积与外界空气接触的内脏器官,极易受到多种损害。运动锻炼作为一种非药物干预方式,对治疗多种慢性疾病以及肥胖相关的代谢综合症均有良好效果。作为一种新型气体信号分子,硫化氢（hydrogen sulfide,H₂S）具有重要的生理调节功能,H₂S代谢紊乱与多种疾病的发生密切相关。肺纤维化是多种肺损伤共有的病理改变并影响疾病的发展与转归。本文第一部分拟通过建立博来霉素（Bleomycin,BLM）诱导的肺纤维化小鼠模型,探讨运动锻炼能否通过提高机体H₂S的水平而改善BLM诱导的肺纤维化。糖皮质激素（Glucocorticoids,GCs）是临床上应用最为广泛的激素类药物,具有抗炎、抗休克等多种生物学效应。GCs主要在肾上腺合成,但有研究发现在肾上腺以外的多种器官均有GCs合成酶与代谢酶的表达并对局部器官中GCs的含量和活性产生影响。本课题组前期研究脓毒症肾上腺皮质耗竭时发现H₂S可促进肾上腺中GCs的合成,那么H₂S是否同样对肺组织中GCs的含量和活性产生影响?综合考虑炎症与纤维化的关系及GCs的抗炎作用,我们很想知道运动锻炼能否通过提高H₂S水平调节局部GCs的合成和代谢进而改善肺组织炎症并影响肺纤维化状态。由于肥胖的典型病理改变之一即为全身慢性炎症状态,因此,本论文第二部分通过建立肥胖小鼠的运动模型,首先探讨了运动锻炼能否通过调节局部GCs的合成或代谢而改善肥胖相关的肺组织炎症。运动锻炼通过H₂S调节局部GCs进而影响肺纤维化的工作我们将在后续研究中陆续开展。研究方法第一部分:首先验证外源性补充H₂S能否改善BLM诱导的小鼠肺纤维化,选择ICR小鼠40只,随机分为4组:对照组（Control,n=10）、博来霉素组（BLM,n=10）、硫化氢组（H₂S,n=10）、博来霉素+硫化氢组（BLM+H₂S,n=10）。然后探讨运动锻炼对肺纤维化的影响,选择ICR小鼠随机分为4组:对照组（Control,n=10）、博来霉素组（BLM,n=10）、运动锻炼组（Ex,n=10）、博来霉素+运动锻炼组（BLM+Ex,n=10）。以5天/周、45min/天、12m/min的运动方案跑台锻炼4周后,进行肺纤维化模型制作,即对BLM组和BLM+Ex组行进行气管滴注博来霉素,Control组和Ex组滴注生理盐水。待小鼠清醒后继续2周的跑台锻炼,6周后收取肺组织样本。采用HE（Hematoxylin and eosin）和Masson染色法检测肺组织的病理学改变和胶原沉淀情况;采用ELISA法检测羟脯氨酸（hydroxyproline）、Ⅰ型胶原（Collagen I）及TGF-β的含量;采用Western blot方法检测上皮细胞标记物E-cadherin和纤维化标记蛋白α-SMA的表达、转录激活因子（P-Smad2、P-Smad3、Smade4）以及硫化氢合成酶CBS和CSE的蛋白表达。第二部分:选择SPF级C57BL/6野生型小鼠（WT）和ob/ob肥胖小鼠（ob）作为研究区对象,根据随机原则小鼠被分为4组:C57BL/6静置组（Sed-WT组,n=10）、C57BL/6运动组（Ex-WT 组,n=10）、ob/ob 静置组（Sed-ob 组,n=10）、ob/ob 运动组（Ex-ob组,n=10）。采用6天/周、1h/天、12m/min的运动方案进行跑台锻炼6周,运动干预结束后收取肺组织和血浆样本。采用ELISA法检测肺组织炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18、MCP-1的水平以及MPO的活性和皮质酮的含量;采用免疫组织化学法标记CD68检测ob小鼠肺组织巨噬细胞浸润程度以及验证GCs关键合成酶 StAR、CYP11A1、CYP21、3β-HSD、CYP11B1 与代谢酶 11β-HSD1、11β-HSD2在小鼠肺组织中是否表达;采用免疫荧光标记、RT-PCR和Western blot方法,定量分析运动锻炼对糖皮质代谢关键酶11β-HSDi和11β-HSD2的影响。RU486是一种GCs受体拮抗剂。为了进一步验证GCs参与运动锻炼的抗炎效果,我们把WT和ob小鼠随机分为6组:Sed-WT组（n=7）,Ex-WT组（n=7）,Ex-WT+RU486 组（n=7）,Sed-ob组（n=7）,Ex-ob 组（n=7）,Ex-ob+RU486组（n=7）。每天注射RU486（30mg/kg/d）或生理盐水,运动方案同上。运动干预结束后收取肺组织,采用ELISA方法检测肺组织炎症细胞因子水平,每周记录一次小鼠体重变化。研究结果第一部分:1.补充外源性H₂S可以改善BLM诱导小鼠肺上皮细胞减少及衰老:免疫荧光显示,与Control组相比,BLM组小鼠肺组织E-cadherin的表达显著减少,p53和p21的表达显著增加;与BLM组相比,BLM+H₂S组小鼠肺组织E-cadherin的表达显著增加,p53和p21的表达显著减少。2.补充外源性H₂S可以改善BLM诱导小鼠肺纤维化:ELISA结果显示,与Control组相比,BLM组小鼠肺组织中羟脯氨酸、I型胶原和TGF-β的含量显著升高（p<0.01,p<0.01,p<0.01）;与BLM组相比,BLM+H₂S组小鼠肺组织中羟脯氨酸、Ⅰ型胶原和TGF-β的含量显著降低（p＜0.05,p<0.01,p<0.01）。3.运动锻炼可以改善BLM诱导的小鼠肺纤维化:HE和Masson染色结果显示,与Control组相比,BLM组小鼠肺组织肺泡壁增厚,结构破坏,胶原沉淀增多;与BLM组相比,BLM+Ex组小鼠肺组织肺泡壁变薄,结构相对完整,胶原沉淀明显减少。ELISA结果显示,与Control组相比,BLM组小鼠肺组织羟脯氨酸、I型胶原及TGF-β的含量均显著升高（p<0.01,p<0.01,p<0.05）;与BLM组相比,BLM+Ex组小鼠肺组织羟脯氨酸、I型胶原及TGF-β的含量均,显著降低（p<0.01,p<0.01,p<0.05）。4.运动锻炼增加上皮黏附分子E-cadherin且降低纤维化标志蛋白α-SMA的表达:与Control组相比,BLM组小鼠肺组织E-cadherin表达显著减少（p<0.01）,α-SMA表达显著增加（p<0.01）;与BLM组相比,BLM+Ex组小鼠肺组织E-cadherin表达显著增加（p<0.01）,α-SMA表达显著减少（p<0.05）。5.运动锻炼抑制BLM诱导TGF-β信号通路的激活:与Control组相比,BLM组小鼠肺组织p-Smad2、p-Smad3、Smad4表达水平均显著升高（p<0.01,p<0.05,p<0.01）;与BLM组相比,BLM+Ex组小鼠肺组织中这三种蛋白表达水平又均显著降低（p<0.01,p<0.05,p<0.01）。6.运动锻炼增加小鼠肺组织中CBS和CSE的表达:与Control相比,BLM组小鼠肺组织CBS和CSE的蛋白表达显著降低（p<0.01,p<0.01）;与BLM组相比,BLM+Ex组小鼠肺组织CBS和CSE的蛋白表达显著升高（p＜0.01 p<0.05）。第二部分:1.运动锻炼降低ob/ob小鼠肺组织炎症细胞因子水平:与Sed-WT组相比,Sed-ob组小鼠肺组织炎症介质IL-1β、IL-18和MCP-1水平均显著升高（p<0.01,p<0.01,p<0.01）,IL-6无显著性改变;与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠肺组织炎症状态明显改善,主要表现为IL-β、IL-18和MCP-1水平显著降低（P<0.05,p<0.05，p<0.01）。2.运动锻炼改善ob/ob小鼠肺组织巨噬细胞浸润程度：与Sed-WT组相比,Sed-ob组小鼠肺组织CD68阳性细胞显著增多（P<0.01）;与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠肺组织CD68阳性细胞显著减少（P<0.01）。3.运动锻炼降低ob小鼠肺组织MPO活性:与Sed-WT组相比,Sed-ob组小鼠肺组织MPO活性显著升高（P<0.01）;与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠肺组织MPO活性显著降低（P<0.05）。4.运动锻炼显著增加小鼠肺组织皮质酮含量,对血浆皮质酮水平无显著性影响:与Sed-WT组相比,Ex-WT组小鼠肺组织皮质酮水平显著升高（P<0.05）,Sed-ob组小鼠肺组织皮质酮水平显著降低（P<0.05）;与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠肺组织皮质酮含量显著升高（P<0.01）。血浆皮质酮水平无显著性改变。5.GCs关键合成酶CYP11B1缺失于小鼠肺组织,且运动锻炼和肥胖并不改变这一现象:免疫组化结果显示,GCs关键合成酶之一 CYP11B1在小鼠肺组织中未见表达,其余关键酶StAR、CYP11A1、3β-HSD和CYP21以及代谢酶11β-HSD1和11β-HSD2在小鼠肺组织中均有表达,且运动锻炼和肥胖均未改变CYP11B1在肺组织中呈阴性表达的结果。6.运动锻炼显著增加小鼠肺组织11β-HSD1的含量:免疫荧光结果显示,与Sed-WT组相比,Ex-WT组小鼠肺组织11β-HSD1的表达显著增加（P<0.01）,11β-HSD2无显著性变化;与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠肺组织11β-HSD1的表达显著增加（P<0.01）,11β-HSD2无显著性变化。Western blot结果也显示,运动锻炼显著增加11β-HSD1的表达（P<0.01）,但不影响11β-HSD2的表达。RT-PCR结果与Western blot结果趋势一致,运动锻炼显著增加11β-HSD1的mRNA水平（P<0.05）,但不影响11β-HSD2的mRNA水平。7.RU486阻断运动锻炼的抗炎效果：与Ex-WT组相比,Ex-WT+RU486组小鼠肺组织中IL-1β、IL-18和MCP-1水平以及MP0的活性均显著升高（P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05）;与Ex-ob组相比,Ex-ob+RU486组小鼠肺组织上述细胞因子水平均显著升高（P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.01）。8.小鼠体重变化:与Sed-WT组相比,Ex-WT组小鼠体重显著下降（p<0.05）,Ex-WT+RU486组小鼠体重显著升高（p<0.05）;与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠体重显著降低（p<0.01）,Ex-ob+RU486组小鼠体重显著升高（p<0.01）。9.运动锻炼增加小鼠肺组织CBS和CSE的蛋白表达:与Sed-WT组相比,Sed-ob组小鼠肺组织CBS和CSE的表达均显著下降（p<0.01,p<0.01）;与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠肺组织CBS和CSE的表达显著升高（p<0.01,p<0.05）。研究结论运动锻炼通过抑制TGF-β信号通路的激活和促进GCs活性的增强,改善了BLM诱导的小鼠肺纤维化和肥胖相关的肺组织炎症,其可能的机制是运动锻炼促进了小鼠肺组织中H₂S水平的提高。