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目的:人类多发性硬化症(Multiple Sclerosis,MS)是一种由多种免疫细胞、免疫分子介导的自身免疫性中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病,自身免疫系统攻击自身组织导致轴索断裂、缺失和脑萎缩,患者出现神经功能残疾。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)与MS具有高度相似的病理学特征,是国内外公认研究MS的理想动物模型。已有研究证明T细胞在EAE疾病进展中起重要作用,其与自身髓鞘抗原相互作用触发炎症级联反应,导致髓鞘脱失、轴索变性。本研究旨在探究人齿龈间充质干细胞外泌体(Gingival Mesenchymal Stem Cell-derived Exosomes,GMSC-Exos)源性miR-223-3p对EAE小鼠的治疗效果,并从CD4+T细胞、NLRP3及JAK/STAT信号通路角度探究其潜在的作用机制。方法:使用外泌体分离试剂盒提取GMSC-Exos,通过透射电镜、Nanosight和Western blot进行鉴定,BCA法测定外泌体浓度。采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(Myelin oligodendrocyte Glycoprotein35-55,MOG35-55)和完全福氏佐剂混合制成乳剂,在C57BL/6J小鼠背部皮下多点注射,同时在免疫当天和免疫后2天尾静脉注射两剂百日咳毒素(Pertussis toxin,PTx)构建EAE模型。免疫后每天观察并记录小鼠的体重和临床评分。将EAE小鼠随机分为9组:PBS组、GW4869-GMSC组、GMSC组、GMSC-Exo组、IL-1β-GMSC-Exo组、pre-GMSCmiR-223-3p-Exo组、pre-GMSCNC-Exo组、GMSCmiR-223-3p-Exo组以及GMSCNC-Exo组。预防组EAE小鼠在免疫后的第5天(Day5)给予治疗,其他治疗组在免疫后的第18天(Day18)给予治疗。免疫后第40天处死小鼠取材。各组小鼠脊髓组织石蜡切片HE染色,观察炎症细胞浸润情况;脊髓组织石蜡切片LFB染色,观察脊髓脱髓鞘情况;流式细胞术检测小鼠脾细胞中effective memory T cell、Naive T cell、central memory T cell、Th1亚群、Th17亚群、Treg亚群及CD4+IL-10+T细胞比例变化;Western Blot检测小鼠脊髓中NLRP3、JAK1、STAT3蛋白表达,探究能否通过抑制NLRP3炎症小体以及JAK/STAT信号通路发挥免疫调节作用;ELISA检测小鼠血清中炎症相关细胞因子(IFN-γ、IL-17A和IL-10)水平的变化。在体外,将CD4+T细胞与不同处理组的齿龈间充质干细胞(GMSCs)或干细胞外泌体直接共培养,流式细胞术检测CD4+T细胞中CD4+T细胞亚群(Th1、Th17)比例变化;ELISA检测共培养上清中IFN-γ、IL-17A、IL-10水平的变化。结果:结果显示,培养的GMSCs符合干细胞基本特征,提取的GMSC-Exos符合外泌体基本特征。使用MOG35-55、CFA以及PTx成功构建了EAE小鼠模型,小鼠在免疫后第10天(Day10)左右开始发病,表现为体重下降和临床评分升高。体内结果显示,与PBS组比较,其他各组对EAE均有不同程度的改善,其中IL-1β-GMSC-Exo组与GMSC-Exo组相比、GMSCmiR-223-3p-Exo组与GMSCNC-Exo组相比,有较为明显的改善作用,脊髓蛋白内NLRP3、JAK1和STAT3均下调;HE染色观察到脊髓后角炎症细胞浸润有较为明显的改善;LFB染色显示脊髓脱髓鞘情况改善;流式结果显示小鼠脾中effective memory T cell、central memory T cell比例降低,Naive T cell比例升高,促炎性Th1、Th17细胞亚群比例降低,抑炎性Treg、CD4+IL-10+T细胞比例升高;血清中促炎细胞因子IFN-γ、IL-17A水平降低,抑炎性IL-10水平升高。体外结果显示,分选的CD4+T细胞与不同处理组的GMSCs或干细胞外泌体共培养后,各组Th1亚群、Th17亚群比例均有不同程度的降低,共培养上清中促炎因子IFN-γ、IL-17A水平降低,抑炎因子IL-10水平升高。GMSC组Th17亚群比例低于GW4869-GMSC组,Th1亚群比例无明显差异,与GMSCNC-Exo组相比,GMSCmiR-223-3p-Exo组Th17亚群比例降低,但对Th1亚群比例的影响无统计学差异。ELISA结果显示,与GW4869-GMSC组相比,GMSC组抑炎因子IL-17A水平降低,但IFN-γ和IL-10水平无明显差异;对抑炎因子影响上,IL-1β-GMSC-Exo组IL-10水平高于GMSC-Exo组且存在统计学差异,说明经IL-1β-GMSC-Exos比未处理的GMSC-Exos有更好的抑炎效果,GMSCmiR-223-3p-Exo组与GMSCNC-Exo组对IFN-γ、IL-17A和IL-10水平影响无显著差异。结论:1.GMSC-Exos与GMSCs具有相似的免疫调节作用,均能有效改善EAE;2.IL-1β-GMSC-Exos与GMSCmiR-223-3p-Exos都有很好的抑炎作用,可以减少髓鞘脱失,降低EAE疾病严重程度;3.IL-1β-GMSC-Exos及GMSCmiR-223-3p-Exos可能通过抑制CD4+T细胞活化,抑制Th1、Th17分化,促进抑炎Treg、CD4+IL-10+T细胞分化缓解炎症;4.IL-1β-GMSC-Exos及GMSCmiR-223-3p-Exos可能通过抑制NLRP3炎症小体及JAK/STAT信号通路缓解炎症,减少脊髓脱髓鞘;综上所述,IL-1β-GMSC-Exos及GMSCmiR-223-3p-Exos可能通过调节CD4+T细胞亚群及抑制NLRP3炎症小体及JAK/STAT信号通路改善EAE。