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鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma)是我国南方省份及东南亚高发的一种恶性肿瘤，具有明显的种族聚集性和地域性。目前普遍认为鼻咽癌是在多种因素协同作用下，经过多步骤、多阶段发生发展形成的，其发生可能与遗传因素、EBV感染、理化环境因素等[1]有关。
鼻咽癌具有颈淋巴结转移早，远处转移发生率高等特点，但是目前对鼻咽癌侵袭和转移的分子机制尚不十分清楚，进一步筛选和鉴定鼻咽癌转移相关基因，并明确其在鼻咽癌转移过程中的作用，对于揭示鼻咽癌转移的分子机制有着重要意义，也对鼻咽癌的治疗及预后判断具有重要的理论和实用价值。
细胞的表型由它所表达的基因种类、表达水平和时空顺序等因素所决定。通过比较遗传背景相同、转移能力不同的肿瘤细胞间的基因表达差异这一途径寻找肿瘤转移相关基因，是一种已经得到公认的筛选策略，但前提条件是要获得具有相同遗传背景、转移能力不同的肿瘤细胞。鼻咽癌细胞5-8F和6-10B均来源于同一母细胞株SUNE-1，既往的研究已经证实，5-8F具有高成瘤、高转移能力，而6-10B则只成瘤、不转移。比较基因组杂交(CGH)的研究结果也表明，5-8F和6-10B细胞在多条染色体上存在缺失、扩增等差异。这两株细胞来自同一亲本，具有相同的遗传背景，两者间的差异主要集中在转移能力上，它们之间的差异表达基因很可能与鼻咽癌转移相关，是用于寻找鼻咽癌转移相关候选基因的理想材料。
本研究首先利用抑制性消减杂交技术，以具有不同转移能力的两株鼻咽癌细胞5-8F和6-10B为材料，建立了两者间差异表达基因的消减cDNA文库并从中筛选出多个在高转移鼻咽癌细胞5-8F中表达上调的基因。通过检索既有文献中相关基因功能的报道，分析这些基因在鼻咽癌转移中可能的作用。在此基础上，我们选择了差异表达基因Flotillin-2为目标进行后续研究。利用RNA干扰技术选择性地沉默5-8F细胞中Flotillin-2基因的表达，通过观察Flotillin-2基因被干扰后对5-8F细胞生物学特性的影响，明确Flotillin-2基因在5-8F细胞中的作用，为Flotillin-2基因与鼻咽癌转移的相关性提供实验证据。实验方法和结果如下：第一部分：不同转移能力鼻咽癌细胞间差异表达基因的筛选采用抑制性消减杂交技术，以高转移鼻咽癌细胞5-8FcDNA为检测子，以不转移鼻咽癌细胞6-10BcDNA为驱赶子，通过两轮消减杂交和两轮抑制性PCR，构建了两者间差异表达基因的消减cDNA文库，得到了上千个差异表达克隆。从该文库中随机挑取192个克隆，采用PCR扩增插入cDNA片段，经0.4NNaOH裂解变性后，按8×12矩阵方式制备了两张斑点杂交膜，分别与经逆转录标记的5-8F细胞和6-10B细胞的第一链cDNA行反向Northern斑点杂交。杂交信号经扫描和对比分析后，获得了差异表达点，对存在2倍差异以上的克隆进行了序列测定，获得了在5-8F细胞中表达上调的20个差异表达基因的cDNA序列。通过与NCBI数据库进行同源性比较，发现其中16个为已知基因(flotilin-2，ezrin,pim-3,fli-1，mel，neugrin，znf216,ASBl，raly,UBE2A，keratin6A，TMED7,EIF3S9,FTL,RPL21及RPL16)，2个为通过电子克隆预测出的基因(c9orf74和MDS006)，2个代表新基因序列。这些差异表达基因的功能涉及到细胞信号转导、细胞运动、细胞增殖、转录调控、DNA损伤修复、蛋白质合成与运输等多个方面。除少部分基因(ezrin、fli-1、flotillin-2、pim-3)有过报道外，大部分基因是首次发现可能与转移表型有关，提示在这些差异表达基因中可能存在鼻咽癌转移相关候选基因。RT-PCR分析表明，与6-10B相比，Flotillin-2基因在高转移鼻咽癌细胞5-8F中的表达明显上调。相关文献检索结果也提示，Flotillin-2基因有作为鼻咽癌转移相关候选基因的功能基础和可能性。
第二部分用RNA干扰技术研究Flotillin-2基因在5-8F细胞的作用采用pSUPER.retro逆病毒载体系统，分别构建了针对Flotillin-2的两个RNAi载体(shFlot2-1和shFlot2-2)。经测序结果证实后，利用脂质体转染技术将shFlot2-1和shFlot2-2分别导入5-8F细胞，嘌呤霉素筛选获得抗性克隆，PCR证实抗性克隆中含有shFlots；RT-PCR结果表明，shFlot2-1和shFlot2-2表达载体均特异性的引起Flotillin-2的表达下调，对其它无关基因没有影响，而且shFlot2-2比shFlot2-1具有更好的RNA干扰效果；WesternBlotting分析表明5-8F-shFlot2-2细胞中Flotillin-2的蛋白表达下调了75％以上，这些说明我们已成功地建立稳定转染shFlots的5-8F细胞系。
随后，我们进一步考察了Flotillin-2的表达被干扰后对5-8F细胞的生物学特性的影响。流式细胞分析结果表明，转染pSUPER.retro空白载体的5-8F细胞与未转染的5-8F细胞的细胞周期分布没有明显改变；而转染shFlot2-2后可以使5-8F细胞停滞于G1期，G1期细胞比例增加(59.11％vs46.28％/44.99％)，S期(30.49％vs39.71％/40.58％)和G2/M期细胞比例减少(10.41％vs14.01％/14.43％)。
MTT法观察5-8F-shFlot2细胞的增殖能力，以转染pSUPER.retro空白载体的5-8F细胞和未转染5-8F细胞作为对照，观察5-8F-shFlot2-2细胞的增殖情况，结果表明5-8F-shFlot2细胞的增殖速度明显低于对照组，统计学分析差异有显著性(P＜0.05)；双层软琼脂集落形成实验发现，5-8F-shFlot2-2细胞形成的集落数明显少于对照组(P＜0.05)。提示Flotillin-2被干扰后导致5-8F细胞的增殖能力和克隆形成能力降低。
利用划痕实验和Matrigel侵袭模型证实，Flotillin-2被干扰后5-8F细胞的侵袭能力和运动能力减弱。裸鼠腹腔内接种后成瘤及转移能力的比较分析结果进一步提示，Flotillin-2被干扰后5-8F细胞的成瘤能力不受影响，转移能力下降。
本实验利用抑制性消减杂交技术，构建了不同转移能力鼻咽癌细胞间差异表达基因的消减cDNA文库，利用反向Northern斑点杂交筛选出了20个在5-8细胞中表达上调基因，发现其中16个为已知基因，2个为通过电子克隆预测出的基因，2个代表新基因序列，为进一步筛选鼻咽癌候选转移相关基因奠定了良好的实验基础。利用RNA干扰技术，建立了稳定表达shFlot2的干扰细胞系，成功地将Flotillin-2基因在5-8F细胞中的表达knockdown；Flotillin-2基因被干扰后5-8F细胞一系列生物学特性和行为的改变提示，Flotillin-2作为鼻咽癌转移相关候选基因的可能性是存在的。但我们还需要进一步收集更多证据，通过体内外实验，最终确定Flotillin-2在转移中可能扮演的角色。