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金黄色葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，SpA)和链球菌蛋白G(streptococcal protein G， SpG)是研究最多的细菌免疫球蛋白结合蛋白(Immunoglobulin (Ig)-binding proteins，IBPs)，其中SpA的分子量大约57KDa,含有5个具有Ig结合功能且重复串联的结构域，为E、D、A、B、C。SpG分子量为65kDa，包含3个具有Ig结合功能且重复串联的结构域，为B1、B2、B3。SpA和SpG均可结合于哺乳动物IgG-Fc的CH2γ和CH3γ间的分界且与IgG-Fc的结合强，已被广泛用于制备、纯化与检测抗体、免疫沉淀试验和免疫吸附治疗，在科研、检测和治疗方面成为了重要的工具。为进一步研究SpA和SpG与Fc的结合特性，在实验室应用噬菌体展示技术对细菌免疫球蛋白结合分子SpA、SpG、PpL中单结构域构成的随机组合文库进行体外进化亲和筛选，获得了A-L (PpL的B3结构域)、A-G2、LD3、LD5、E-B-B3以及D-A-B3-B3等多种新型进化免疫球蛋白结合分子(Novel evolved Ig-binding molecules，NEIBMs)基础上，本研究采用不同亚类小鼠IgG抗体IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3对以SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体展示文库进行体外进化亲和筛选，以期获得与小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3具有不同结合活性的新型组合分子，为进一步研究不同亚类小鼠IgG Fc段构像及与SpA或SpG的结合特点提供了新的参考分子。本研究共分以下三个部分：第一部分不同亚类小鼠IgG对以SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体文库的亲和筛选采用小鼠IgG抗体IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3为诱饵分子对以SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体文库进化体外进化筛选，通过“吸附”-“洗脱”-“扩增”的重复过程，经几轮筛选，以不同亚类小鼠IgG为诱饵分子的文库中掺入的空噬菌体及插入单个结构域完全消失且全部是插入两个结构域，提示文库均进化完全。对以小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3为诱饵分子对噬菌体文库进行亲和筛选的鉴定平板中，从第5、4、、5和5代分别都随机挑选10个阳性单克隆进行序列测定。序列测定结果经DNAssist软件进行分析，得知以小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3为诱饵分子筛选到的优势组合分子分别是：DD、DD、AC和DC。第二部分噬菌体ELISA方法鉴定筛选到的优势组合分子的结合能力采用噬菌体ELISA的方法进一步的验证筛选获得的代表性组合序列DD、AC和DC与不同亚类小鼠IgG的结合活性。结果表明：以小鼠的某种抗体为诱饵分子对混合的噬菌体文库筛选出的优势组合分子，在噬菌体水平上与该小鼠抗体的结合能力相对其他组合分子较强：即以小鼠IgG1为诱饵分子筛选到的组合分子为DD，其在噬菌体水平上与小鼠IgG1的结合活性相较于AC和DC较强；以小鼠IgG2a为诱饵分子筛选到的组合分子为DD，其在噬菌体水平上与小鼠IgG2a的结合活性相较于AC和DC较强；以小鼠IgG2b为诱饵分子筛选到的组合分子为AC，其在噬菌体水平上与小鼠IgG2b的结合活性相较于DD和DC较强；以小鼠IgG3为诱饵分子筛选到的组合分子为DC，其在噬菌体水平上与小鼠IgG3的结合活性相较于DD和AC较强；这种结果和我们的亲和筛选是相一致的。第三部分噬菌体展示代表性组合分子的原核表达、纯化及功能鉴定为了进一步检测3种组合分子结合特性，我们将这3种组合分子DD、AC和DC分别克隆于原核表达载体pET32a(+)中，构建的重组表达载体pET32a-DDC、pET32a-AC和pET32a-DC、。将这3种构建好重组表达载体分别转化表达菌BL21，经IPTG诱导表达，超声破菌，离心制备细胞液及包涵体，SDS-PAGE结果分析显示，细菌胞液中出现了分子量大小为35Kda的表达蛋白，与目的蛋白理论分子量大小是相一致。然后，大量诱导表达这3种蛋白，用Ni-NTA柱亲和层析纯化，获得纯度大于90%的3种蛋白，分别命名为DD、AC和DC。将这3种经HRP标记后分别命名为HRP-DD、HRP-AC和HRP-DC，采用ELISA的方法比较这三种蛋白和阳性对照HRP-SpA与不同亚类小鼠IgG和人IgG的结合活性。ELISA结果显示：（1）人IgG,小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3与HRP-SPA结合活性都很强；（2）人IgG,小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3与HRP-SpA、HRP-DD、HRP-AC、 HRP-DC的结合活性强弱具有一致性，且均为：人IgG>IgG3>IgG2a>IgG2b>IgG1。总结：1、本研究成功采用小鼠IgG抗体IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3对SpA、SpG单结构域随机组合噬菌体展示文库进行体外分子进化筛选，获得了3种新的天然分子中不存在的且分别与小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3具有结合优势的组合分子： DD、DD、AC和DC.2、在噬菌体水平上进一步验证了筛选结果。3、原核表达融合蛋白DD、AC和DC，HRP标记后与不同亚类小鼠IgG及人IgG结合能力弱于天然HRP-SpA分子，但是其与不同亚类小鼠IgG及人IgG结合活性的强弱均具有一致性，即：人IgG>IgG3>IgG2a>IgG2b>IgG1。本研究成功的采用不同亚类小鼠IgG抗体IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3对以SpA和SpG单结构域构成的随机组合噬菌体展示文库进行体外进化亲和筛选，获得了与小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3具有不同结合活性的新型组合分子：DD、DD、AC和DC，为进一步研究不同亚类小鼠IgG Fc段构像及与SpA或SpG的结合特点提供了新的参考分子。