mRNA及蛋白质表达定量技术是研究家兔氨基酸吸收及PepT1转运特性的必要技术手段,本研究采用Real Time PCR方法测定了不同日龄的家兔肠道内PepT1、CATI、EAAC1mRNA的表达量及不同饲粮蛋白水平下的肠道内PepT1、CAT1、EAAC1mRNA的表达量。分析年龄、肠道不同部位、不同的饲粮蛋白水平对家兔小肽、碱性氨基酸、酸性氨基酸吸收的影响。为了从蛋白水平上研究小肽的吸收,本研究通过基因工程的方法建立了通过原核表达获得家兔PepT1蛋白的模型,为获取蛋白抗体,并通过蛋白水平研究家兔小肽的吸收奠定基础。不同日龄家兔消化道各段PepT1、CAT1、EAAC1 mRNA的表达量分析(试验一)。试验用家兔自断奶开始维持饲料的同质化,并统一自由采食。通过荧光定量PCR的方法测定15、30、60、90日龄胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠内PepT1、CAT1、EAAC1mRNA的表达量。结果表明,同一日龄肠道各段的表达量结果,PepT1的表达量:相同日龄不同消化道之间进行表达量分析,结果各组均为回肠的表达量最(P<0.05)。相同肠段不同日龄之间进行表达量分析,结果除结肠随年龄的增加表达量有逐渐递增的趋势外(P>0.05),其余各组均在60日龄时表达量达到峰值(P<0.05)。CAT1mRNA的表达量:相同日龄不同消化道之间进行表达量分析,结果除15日龄胃中表达量最高(P<0.05),其余各日龄中十二指肠的表达量最高(P<0.05)。相同肠段不同日龄之间进行表达量分析,在胃中15日龄表达量最高(P<0.05),盲肠在30日龄表达量最高,十二指肠、回肠、空肠、结肠在60日龄时表达量最高(P<0.05)。EAAC1mRNA的表达量:相同日龄不同消化道之间进行表达量分析,15日龄、60日龄中空肠的表达量最高(P<0.05),30日龄、90日龄中回肠表达量最高(P<0.05),各组均为空肠、回肠表达量相对较高。相同肠段不同日龄之间进行表达量分析,`胃、盲肠中15日龄表达量最高,回肠30日龄表达量最高(P<0.05),十二指肠、空肠、结肠中60日龄表达量最高(P<0.05)。不同饲粮蛋白水平对家兔消化道各段PepT1、CAT1、EAAC1 mRNA的表达量的影响(试验二)。设计饲粮配方,试验分三组:低蛋白水平组、对照组、高蛋白水平组。饲粮蛋白水平设计梯度为12.8%、16%、19.2%。实测蛋白浓度值为12.4%、15.3%、17.8%。试验每组30只家兔,试验兔为断奶1月龄泰山大白兔,每天等量饲喂,试验共进行40天,每组八只屠宰采取肠道各组织样品。通过荧光定量PCR的方法测定十二指肠、空肠、回肠内PepT1、CAT1、EAAC1mRNA的表达量。结果表明,CAT1:十二指肠中对照组表达量最高,空肠、回肠中随蛋白水平的升高表达量有升高的趋势(P<0.05)。EAAC1:在小肠中中随蛋白水平的升高表达量差异不显著(P>0.05),PepT1:在十二指肠、空肠、回肠中均为对照组表达量最高。家兔PepTI的克隆及原核表达(试验三)。通过RT-PCR技术扩增家兔I型肽载体CDS区编码片段,并且通过原核表达获得重组家兔I型肽载体蛋白,奠定制备多克隆抗体的基础。结果表明,成功扩增出2001bp家兔PepT 1部分CDS编码区及用于原核表达的1071bp抗原表位相对集中的基因片段;克隆载体经过DNA序列鉴定,所得基因与NCBI报道的完全一致;成功构建表达载体pET-32a-M、pET-28a-M;经IPTG诱导,表达出了6@His-M融合蛋白,用组氨酸标签抗体做Western印记证明产物大约44 ku,与预期大小相符,(结论)家兔PepT I蛋白在大肠杆菌(BL21)中成功的进行了表达。