论文部分内容阅读
角质酶(cutinase，EC3.1.1.94)是一种丝氨酸酯酶，隶属于α/β水解酶，可催化水解酯键，底物包括不溶性植物角质、短链或长链脂肪酸酯、合成聚酯及乳化的甘油三酯等。角质酶能代替传统的碱煮工艺用于棉纤维的生物精炼，去除棉纤维表面的角质和蜡质，并且有助于果胶质、蛋白质等其它杂质的进一步去除。角质酶的研究开发可促进纺织工业的节能、降耗、减排，是生态纺织工业近年来新的研究方向。
本论文选择来自嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)的耐热型角质酶(简称 TfC)为研究对象，解析得到1.54 A的高分辨率晶体结构，根据结构信息设计一系列突变体，并从中成功地筛选到对大分子底物番茄角质催化活性提高4倍的突变体L90A和1.4倍的突变体1213A。
我们首先通过三步纯化法制备高纯度的TfC蛋白，利用座滴式气相扩散法培养得到高衍射质量的单晶，在上海同步辐射光源收集到1.54(A)的衍射数据。然后通过分子置换法解析得到晶体结构，结构精修后的R因子为20.8％，自由R因子为21.6％。晶体结构显示TfC角质酶的活性中心为Ser130-His208-Asp176，氧洞为Try60-Met131，底物位置由一个水分子占据。进一步采用分子对接法构建TfC角质酶与链状小分子聚酯C18H34O5的复合物结构，通过结构分析找到可能影响酶催化中心底物结合和招募能力的17个氨基酸，分别对它们进行了定点突变、表达和纯化。
接着，我们采用酶标仪在405 nm测试角质酶及其突变体对小分子底物对硝基苯丁酸酯(pNPB)的水解活力，筛选出活力基本保持或有所提高的突变体7个；然后利用恒电位滴定法测量其对大分子底物番茄角质的水解效果，并最终筛选到高效突变体L90A和I213A，他们水解番茄角质的活性分别是野生型TfC角质酶的5倍和2.4倍。分子动力学模拟结果显示：L90A、I213A突变体使loop结合区域整体柔性增大，向溶剂偏移，同时使关键残基Try60和Phe209构象偏转，从而有更大空间容纳底物的进入。这两个突变体能有效减小结合区域空间位阻，增大结合口袋，提高对底物的亲和力，进而提高对大分子聚酯的水解活力。
最后，我们将筛选到的高效突变体应用到棉针织物表面改性处理上，处理后的织物表面润湿性能明显改观。扫描电子显微镜(SEM)显示，各突变体与果胶酶复配后能有效去除棉纤维表面的角质、果胶质和蜡质，其作用在融合纤维素结合域CBMCenA后进一步增强。L90A角质酶-CBMcenA与织物作用10小时可基本除去织物表面的杂质，可达到10 g/L烧碱处理6小时的水平，处理后的织物表面光滑，同时对内部纤维结构无损伤。与传统的碱煮工艺相比专一、温和、高效，后处理简单、低污染，具有极高的潜在工业应用价值。