拟穴青蟹是我国南部沿海的主要经济蟹养殖品种，具有很高经济价值。然而，近年来青蟹养殖疾病的频频爆发，造成了巨大的经济损失，严重阻碍了养殖业的发展。前期研究表明，副溶血弧菌是汕头牛田洋青蟹养殖病害的主要致病菌之一。本研究以牛田洋青蟹为对象，研究副溶血型弧菌胁迫条件下拟穴青蟹相关免疫因子应答研究及免疫相关基因NOS的鉴定，为青蟹疾病防治及健康养殖奠定基础。研究结果如下：　　1.副溶血弧菌胁迫下拟穴青蟹多种相关免疫因子活力检测　　实验条件下副溶血弧菌感染青蟹，测定不同时间拟穴青蟹的免疫相关因子的变化。结果显示：试验过程中拟穴青蟹血细胞总数HTC随时间延长一直呈现下降趋势。总血细胞酚氧化酶PO活力18h显著高于对照组，其他时间点无显著变化。血清酚氧化酶PO活力在114h达到最大。血清超氧化物歧化酶SOD活力在6h到达最高值。血清酸性磷酸酶ACP活力和碱性磷酸酶ALP活力在42h开始上升至114h达到最高。血清POD活力在18h开始上升至114h达到最高值。感染副溶血弧菌后，拟穴青蟹血细胞NOS酶活力升高，18h后没显著差异，114h降到最低；血清NOS酶活力一直处于较高水平。荧光实时定量PCR结果显示：proPO基因转录水平应激上升，90h达到最高；Cu/Zn-SOD转录水平在6h、42h、90h、114h处较高；CAT转录水平一直处于较低水平，其中42h最低；td-SOD转录水平只在6h显著高于对照组；LYS基因转录水平一直高于对照组，其中18h最高；CRU基因转录水平114h达到最高；ALFP基因转录水平66h处最高。　　2.拟穴青蟹一氧化氮合成酶NOS克隆及鉴定。　　利用RACE获得NOScDNA序列，其全长4426bp，5’端和3’端非编码序列分别为239bp和538bp，开放阅读框3645bp，编码1214个氨基酸。该酶等电点为6.56，没有信号肽，没有跨膜结构，含有10个糖基化及68个磷酸化修饰位点，说明拟穴青蟹NOS酶活性及功能可能受磷酸化和糖基化修饰及调节，并且该酶不属于膜蛋白，其存在于细胞质及细胞间质内。青蟹NOS与哺乳动物和昆虫纲NOS亲缘关系较远，跟软甲纲动物亲缘关系较近，且广泛表达于青蟹不同组织中。拟穴青蟹副溶血弧菌、脂多糖胁迫、polyI：C等刺激条件下，其中肠、肝胰腺、血细胞中NOS基因的表达及NOS酶活力均有不同程度的上调，这说明NOS基因参与拟穴青蟹免疫应激反应，具有免疫相关功能。　　3.青蟹NOS启动子序列的克隆及初步分析　　利用染色体步移技术，得到了拟穴青蟹一氧化氮合成酶NOS基因5’端上游侧翼序列1722bp；结果显示，该段上游侧翼序列包括一个基础启动子区域，具有TATA框和CAAT框等一般启动子特征，另外该段测序序列还存在很多潜在顺式作用元件。NeuralNetworkPromoterPrediction启动子预测软件，结果表明正链在-277～-228处存在可能的基础启动子区域，其cutoff值为0.98。另外启动子的启动活性正在进一步研究之中。　　本研究的主要创新之处：①.本研究结合生化检测及基因表达角度，研究拟穴青蟹在副溶血弧菌注射后，其免疫相关因子应答特性。②.克隆了拟穴青蟹NOS基因cDNA全长，初步预测了NOS理化性质和蛋白结构功能，并分析了该基因的组织特异性及应激表达特性。③.克隆了NOS基因5’端上游侧翼序列，初步预测分析了其基本启动子区域、转录起始位点和潜在顺式作用元件。