目的:A族链球菌(groupA streptococcus，GAS)是一种常见的革兰氏阳性菌，可以引起多种侵袭性感染和自身免疫性疾病。在大多数发展中国家GAS感染导致的风湿热、风湿性心脏病、肾小球肾炎等仍然是严重威胁人们生活质量的一大问题。而对于GAS感染的治疗目前大多为青霉素、大环内酯类药物或静脉注射免疫球蛋白，但由于耐药性或保护作用短暂等原因致使GAS感染仍旧保持着很高的复发率。所以制备成功有效的GAS疫苗成为GAS预防和治疗的研究热点。　　本室前期已构建了包含7个FbaA表位和M蛋白1、3、6、18血清型的与人无交叉反应的部分基因及M蛋白的C端共同基序（J基因）的pET28a/F7M5[1]，但是根据近期新的流行病学调查显示，我国大部分地区GAS流行菌株中M12血清型占了一大部分。故本实验在本室构建好的质粒的外源基因序列上插入M12与人无交叉反应的基因片段并表达，该蛋白命名为F7M6，又以其为模板构建表达了只含有6个不同M蛋白血清型的基因片段，该蛋白命名为M6。将F7M6蛋白，M6蛋白和本室保存的M1全长蛋白（简称M蛋白）分别免疫小鼠，通过ELISPOT、ELISA等实验技术观察细胞免疫和体液免疫效果，并攻毒后计算存活率，以确定疫苗保护效果。　　方法:　　1利用生物信息学方法在美国疾病预防和控制中心(CDC)数据库获GAS M12血清型的基因序列，通过与人体组织基因比对选取与人无交叉反应的特异性序列，采用搭桥PCR的方法扩增并插入F7M5序列中，得到F7M6序列。　　2在线预测F7M6序列表位。　　3在线预测F7M6蛋白空间结构和亲水性分析。　　4以F7M6序列为模板，PCR扩增出含有M蛋白1、3、6、18、12血清型和M蛋白C端共同基序（J基因）的基因序列，得到M6序列。　　5将两段基因片段克隆至载体pET28a中，测序正确后将阳性质粒分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，SDS-PAGE电泳观察结果，Western blot鉴定。采用亲和层析纯化方法对两种蛋白进行纯化。　　6将纯化的两种蛋白，连同本室保存的GAS M蛋白，以相同剂量联合佐剂分别免疫小鼠，腹部皮下多点注射，同时设立PBS对照组。每组12只，20μg/每只;免疫间隔21天，共免疫4次;于每次免疫10天后下颌窦静脉取血，分离血清，-80℃保存备用。　　7末次免疫后10天，处死6只小鼠，ELISPOT检测小鼠脾脏免疫细胞表达IL-4和IFN-γ的水平，ELISA检测各组血清中IgG、IgG1、IgG2a的水平及动态变化。　　8用ELISA法检测临床获取的抗链“O”阳性和健康儿童血清与F7M6蛋白的特异性结合能力。　　9采用全菌ELIAS法，检测临床获取的GAS菌株与F7M6组血清的结合能力。　　10用致死量的M1GAS腹腔攻击各组剩余下的6只小鼠，观察并计算各组存活率。　　结果:　　1成功构建了pET28a/F7M6、pET28a/M6阳性质粒，并成功表达蛋白。Western blot结果显示两种蛋白均可以与F7M5抗体杂交。　　2 ELISA检测各组血清，结果显示，随免疫次数增加，IgG水平逐渐增高，F7M6组效价达到1∶669309，M6组效价达到1∶58158，M蛋白组达到1∶32980，。F7M6组显著高于M6组和M蛋白组(P＜0.001)，但M6组和M蛋白组间无统计学差异。　　3血清IgG1和IgG2a检测结果显示，三组均可诱导较高水平的相应抗体，均显著高于PBS组(P＜0.001)，IgG1各组间没有显著差异，IgG2a水平则F7M6组显著高于M6组(P=0.009)，但F7M6组与M蛋白组、M6与M蛋白组间没有差异。　　4 ELISPOT结果显示，IL-4，IFN-γ水平:F7M6、M6和M蛋白组均显著高于PBS组(P＜0.001)，且F7M6组的水平最高，而M蛋白组高于M6组(P＜0.05)。　　5用F7M6蛋白作为诊断抗原检测抗链“O”阳性的病人血清及健康人血清，结果显示，抗链“O”阳性的病人血清，阳性检出率为(95％)，而健康儿童血清的阳性率为(47.3％)，二者差异具有统计学意义(P＜0.005)。　　6 ELISA检测4株临床株于不同组的血清的结合能力，结果显示F7M6均能与其结合。　　7攻毒后，F7M6、M6和M蛋白各组生存率分别为66.7％、33.3％和66.7％，PBS组全部死亡。统计分析显示各实验组均高于PBS组(P＜0.05)。　　结论:　　1成功构建并表达F7M6和M6蛋白。　　2 F7M6、M6和M蛋白免疫小鼠后均可引起较好的细胞免疫和体液免疫应答，对GAS感染有保护作用，以F7M6效果最佳，并且F7M6的多价表位涵盖了时下流行的大部分GAS的血清型。