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背景:原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是目前致死率最高的上皮来源恶性肿瘤之一,近年来在我国的发病率依然居高不下。淋巴道转移是恶性肿瘤最早的出现的转移方式,是造成肝癌高侵袭、高复发以及预后差的主要原因之一。国内外许多研究结果表明淋巴道转移机制受许多基因调控,它们或被激活或被抑制,或相互协调或互相拮抗,其中包括细胞增殖、粘附、迁移、细胞外基质降解等多个阶段与环节。膜联蛋白A7(Annexin A7)是本课题组前期发现的潜在决定小鼠肝癌淋巴道转移的关键基因之一,对各种肿瘤细胞生长、分化、增殖、分泌、侵袭、迁移乃至凋亡能力均可产生影响。同时Annexin A7基因是ca2+磷脂结合蛋白,具有ca2+依赖膜融合活性,可促进膜聚集、融合、粘着、运输等,还可激活GTP酶,介导ca2+/GTP信号转导通路。腺苷酸环化酶联合蛋白(adenylate cyclase-associated protein 1,CAP1)最早发现于酵母,在其中可调节Ras/c AMP信号通路,并且与哺乳动物CAP1具有相同作用调节肌动蛋白的周转与重组,对细胞迁移产生影响。近年来关于CAP1与肿瘤转移关系的研究逐渐深入,但似乎在不同肿瘤细胞中对于细胞生物学功能的影响不尽相同。黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶,在许多上皮来源的肿瘤细胞中过表达,如乳腺癌、结肠癌、口腔癌、甲状腺癌、卵巢癌和胃癌等,可能在肿瘤生长、增殖、侵袭、转移及血管形成中产生影响。Src为SRC酪氨酸激酶家族成员,参与细胞生长、分化、粘着、增殖、凋亡及细胞运动等过程。桩蛋白(Paxillin)是一种主要定位于黏着斑的关键衔接蛋白信号分子,是FAK下游重要的焦点粘附调节蛋白之一,其异常表达与肿瘤的发生、增殖、粘附、浸润、骨架重组及转移能力的改变密切关联。E-钙黏蛋白(E-cadherin,CDH1)是与肿瘤转移侵袭密切相关的一种钙粘蛋白,可参与细胞极性、细胞形态与组织结构完整性的维持,与肿瘤细胞的良恶性及转移程度呈负相关。目的:通过细胞脂质体转染、qRT-PCR、Western Blot等技术观察对比下调小鼠肝癌Hca-P细胞Annexin A7与CAP1基因后观察其对细胞黏附相关分子FAK、Src、Paxillin、E-cadherin基因及蛋白表达水平的调控。通过CCK-8增殖检测、流式细胞仪凋亡检测、小鼠淋巴结粘附以及Transwell小室等实验方法观察CAP1下调对Hca-P细胞生物学行为的影响。对比Annexin A7与CAP1下调后对彼此基因和蛋白表达水平的影响以及二者在Hca-P细胞的表达定位。方法:1.构建PGPUP-GFP-neo-sh RNA-Annexin A7和PGPUP-GFP-neo-sh NC表达载体,稳定转染至小鼠Hca-P细胞,获得Annexin A7下调表达及无关序列Hca-P细胞株,应用qRT-PCR、Western Blot技术验证Annexin A7基因下调对CAP1、FAK、SRC、E-cadherin基因及蛋白表达水平的影响。2.构建PGPUP-GFP-neo-sh RNA-CAP1和PGPUP-GFP-neo-sh NC表达载体,稳定转染至Hca-P细胞,获得CAP1下调表达及无关序列Hca-P细胞株,应用qRT-PCR、Western Blot技术验证CAP1基因下调对FAK、Src、Paxillin、E-cadherin基因及蛋白表达水平的影响。3.获得CAP1下调表达及无关序列Hca-P细胞株后,应用CCK-8增殖检测、流式细胞仪凋亡检测、小鼠淋巴结粘附以及Transwell小室等实验方法,对比CAP1下调组与对照组增殖、凋亡、粘附、侵袭、迁移能力,分析CAP1对Hca-P细胞生物学行为的影响。4.应用qRT-PCR、Western Blot技术验证Annexin A7基因下调对CAP1基因及蛋白表达水平的影响。采用细胞免疫荧光技术检测Annexin A7与CAP1表达的共定位。结果:1、在mRNA表达水平上,Annexin A7在ShRNA-A7细胞组较A7无关序列细胞组及Hca-P细胞组分别降低82.86%和82.78%(P<0.05),而在A7无关序列组及Hca-P组间差异不明显(P>0.05)。FAK、Src基因在ShRNA-A7细胞组表达分别为A7无关序列组及Hca-P组的1.88倍、1.67倍和1.78倍、1.54倍(P<0.05),二者在A7无关序列组及Hca-P组间差异不明显(P>0.05)。E-cadherin基因在ShRNA-A7细胞组较A7无关序列细胞组及Hca-P细胞组分别降低49.88%和43.01%(P<0.05),在A7无关序列组及Hca-P组间差异不明显(P>0.05)。在蛋白质表达水平上,Annexin A7在ShRNA-A7细胞组中蛋白表达水平较A7无关序列组及Hca-P细胞组降低62.75%和60.34%(P<0.05),而在Hca-P与A7无关序列组间不存在明显差异(P>0.05)。FAK及Src在ShRNA-A7细胞组较A7无关序列组及Hca-P组蛋白表达量上升1.80倍、1.52倍及1.59、1.58倍(P<0.05),E-cadherin蛋白在ShRNA-A7细胞组较A7无关序列组与Hca-P组下降54.27%和59.11%(P<0.05),但三种蛋白在Hca-P与A7无关序列组间不存在明显差异(P>0.05)。2、在mRNA表达水平上,CAP1在ShRNA-CAP1细胞组较CAP1无关序列细胞组及Hca-P细胞组分别降低60.73%和65.25%(P<0.05),而在CAP1无关序列组及Hca-P组间差异不明显(P>0.05)。FAK、Src、Paxillin基因在ShRNA-A7细胞组表达分别为A7无关序列组及Hca-P组的2.47倍、2.18倍和1.64倍、1.76倍及1.67倍、1.58倍,三者在CAP1无关序列组及Hca-P组间差异不明显(P>0.05)。E-cadherin基因在ShRNA-CAP1细胞组较CAP1无关序列细胞组及Hca-P细胞组分别降低40.11%和43.01%(P<0.05),在CAP1无关序列组及Hca-P组间差异不明显(P>0.05)。在蛋白质表达水平上,CAP1在ShRNA-CAP1细胞组中蛋白表达水平较CAP1无关序列组与Hca-P组降低50.83%和50.29%(P<0.05),而在Hca-P与CAP1无关序列组间差异不明显(P>0.05)。FAK、SRC及Paxillin在ShRNA-CAP1细胞组较CAP1无关序列组和Hca-P组蛋白表达量分别升高1.64倍和1.60倍、1.67倍和1.61倍、1.43倍和1.39倍(P<0.05),E-cadherin蛋白表达水平在ShRNA-CAP1组较CAP1无关序列组及Hca-P组均有下降,下降幅度为39.6%及48.22%(P<0.05),但FAK、SRC、Paxillin及E-cadherin四者在Hca-P细胞组与CAP1无关序列细胞组之间表达量不存在明显差异(P>0.05)。3、CCK-8增殖实验分别检测Hca-P细胞组、ShRNA-CAP1细胞组与CAP1无关序列细胞组在0h、24h、48h、72h、96h等时间段的吸光值,其中ShRNA-CAP1细胞组各时间点吸光值均数±标准差分别为0.106±0.015、0.152±0.010、0.522±0.049、0.651±0.040、0.651±0.040、0.708±0.037;CAP1无关序列细胞组各时间点吸光值均数±标准差分别为0.095±0.017、0.144±0.024、0.374±0.027、0.485±0.018、0.535±0.039;Hca-P细胞组各时间点吸光值均数±标准差分别为0.101±0.014、0.153±0.006、0.410±0.021、0.553±0.022、0.601±0.030,结果提示Hca-P、ShRNA-CAP1、CAP1无关序列三种细胞数量在24小时内不存在显著差异(P>0.05),自48小时起开始产生明显差异,每个时间点差异均显著(P<0.05),且ShRNA-CAP1细胞增殖能力始终高于CAP1无关序列细胞组及Hca-P细胞组,CAP1无关序列组与Hca-P组的增殖能力在各时间段无显著差异(P>0.05)。4、流式细胞仪分别检测Hca-P细胞组、ShRNA-CAP1细胞组与CAP1无关序列细胞组早期凋亡能力,结果显示三组细胞早期凋亡细胞比例分别为6.33%±0.17%,3.41%±0.22%及6.43%±0.25%,提示在CAP1基因低表达后,ShRNA-CAP1细胞组早期凋亡细胞数低于CAP1无关序列及Hca-P细胞组。5、淋巴结粘附实验检测Hca-P组、ShRNA-CAP1组与CAP1无关序列组细胞淋巴结粘附能力,三种细胞组粘附于淋巴结的细胞数目分别为255.67±28.43、734.33±67.50、228.33±20.03,提示在CAP1基因低表达后,ShRNA-CAP1细胞组对于小鼠淋巴结的黏附能力强于Hca-P细胞组与CAP1无关序列细胞组。6、Transwell小室细胞侵袭实验中Hca-P细胞组、ShRNA-CAP1细胞组与N2-Control细胞组穿透小室膜的细胞数目均数±标准差分别为61.00±8.51、173.00±18.03、58.00±6.40,提示ShRNA-CAP1细胞组穿过小室的细胞数目明显多于CAP1无关序列细胞组及Hca-P细胞组,CAP1无关序列细胞组与Hca-P细胞组对比则差异不显著(P>0.05)。7、对Annexin A7与CAP1相互关系的分析提示,在Annexin A7基因表达下调后,CAP1基因与蛋白表达水平均降低,其中,ShRNA-A7细胞组与A7无关序列细胞组对比,CAP1基因下调至原水平的17.21%(P<0.05),CAP1蛋白表达水平下调至原水平的46.86%(P<0.05),表明Annexin A7基因低表达后,CAP1基因与蛋白水平均随之下降。另外通过免疫荧光方法证明Annexin A7与CAP1均主要在在Hca-P细胞浆内表达,少量表达于细胞核,由图像结果推测两种蛋白可能在细胞浆及邻近细胞内膜处共定位。结论:Annexin A7与CAP1基因分别可调控FAK、SRC、Paxillin、E-cadherin的表达,在mRNA和蛋白质水平,FAK、SRC、Paxillin均随Annexin A7与CAP1基因的下调而高表达,而E-cadherin则在上述两基因表达下调后低表达。CAP1低表达后,Hca-P细胞增殖、淋巴结黏附、侵袭能力均有所上升,早期凋亡能力下降;Annexin A7基因下调表达后,CAP1在mRNA和蛋白质水平随之下调,且两基因在Hca-P细胞内表达位置基本一致,可能存在共定位。Annexin A7基因可能与CAP1基因存在一定分子机制的关联,可对细胞粘附转移分子产生一致性影响,并对肝癌Hca-P细胞的生物学行为的产生密切相关。